骨髓间充质干细胞治疗类风湿关节炎机制和相关研究

论文摘要

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种高度致残的自身免疫性疾病,是我国造成劳动力丧失和致残的主要病因之一。RA目前尚无根治的方法,临床上所用药物仪能够在一定范围和程度上改善症状、延缓病情进展,且这些药物的副作用较大。另外,迄今为止的研究认为,RA造成的关节滑膜和软骨的破坏是不可逆转的,药物治疗无效,后期关节变形只能借助外科手术矫正。所以目前临床上急需寻找一种有效控制甚至根治类风湿关节炎的方法。骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）是一种具有高度自我增殖能力和多向分化潜能的干细胞。研究表明它具有免疫调节特性,MSCs在维持机体免疫平衡耐受、移植免疫耐受、自身免疫和肿瘤免疫逃逸以及胎-母免疫耐受方面都起到了一个重要作用。MSCs可以作用于T、B淋巴细胞,NK细胞,DC细胞等参与机体免疫调节。另外组织修复是MCSs又一个重要的特性,它参与多种组织的再生和修复。MSCs是一种基质千细胞,在特定的诱导条件下可以分化成多系组织细胞,同时MSCs可以分泌多种基质分子,改善局部受损环境加速损伤修复。近几年临床上MSCs在免疫方面的特性和免疫调节作用越来越受到关注,并有望成为治疗免疫性疾病的工具。所以利用骨髓间充质干细胞定向趋化、调节免疫、促血管和软骨修复等作用有可能为治疗类风湿关节炎找到新的出路。因此,MSCs是否可以治疗RA,以及其治疗机制值得深入研究。本文主要在MSCs治疗类风湿关节炎方面进行了一部分相关的研究。为临床上利用MSCs治疗RA提供可靠的实验基础和理论依据。本文的第一部分主要是骨髓间充质干细胞调节类风湿关节炎患者免疫机制的体外研究。体外实验中我们采集了类风湿关节炎患者的骨髓标本,分离、培养和扩增了RA患者骨髓间充质干细胞,观察了原代和传代的类风湿关节炎患者骨髓间充质千细胞的细胞形态,体外增殖能力、集落形成状况、细胞表面标记、以及电镜超微结构等一般生物学特性;另外在体外实验中我们将MSCs与RA患者T,B淋巴细胞共培养,观察了不同比例状态下MSCs共培养对RA患者T,B淋巴细胞的增殖,活化和功能成熟以及对其免疫调节和产生细胞因子等的影响。实验结果显示,来自RA患者的MSCs呈典型的成纤维样细胞形态、表型鉴定CD45阴性,SH2（CD105）、CD71、CD44均阳性,其增殖能力和CFU-F集落形成状况、以及电镜超微结构等方面都与来源于健康对照组的MSCs无明显差异;MSCs与RA患者T、B淋巴细胞共培养研究发现,正常骨髓来源的MSCs对PHA和SAC刺激的RA患者T、B淋巴细胞的增殖均有抑制作用,并且这种抑制作用与BM-MSC的剂量呈依赖性;MSCs可以阻止T细胞进入细胞增殖周期;MSCs可以明显抑制活化的RA患者T淋巴细胞凋亡;但是MSC能促进B细胞功能成熟,分泌IgG增加。结果提示MSCs在多个环节对T,B淋巴细胞有免疫调节作用,并且上述的免疫调节作用不受MHC的限制。在MSCs对细胞因子产生影响的研究中,我们分别用ELASA方法检测了MSCs与RA患者淋巴细胞共培养上清液中IL-1、TNF-a、TGF-β1的含量,同时用RT-PCR检测了细胞内IL-1、TNF-a、TGF-β1的基因表达。我们看到MSCs与患者淋巴细胞共培养时可以影响IL-1、TNF-a及TGF-β1等细胞因子的产生和表达。在第二部分的研究中,我们利用动物实验主要探讨了在机体内环境下,MSCs对类风湿关节炎大鼠模型的免疫紊乱调节和关节滑膜、软骨损伤的修复效应,以及MSCs治疗类风湿关节炎的可行性、作用机制和治疗途径。我们将体外培养扩增后的MSCs经Brdu标记后从实验动物尾静脉注入,对模型大鼠进行异基因MSCs移植治疗。观察了治疗前后实验动物一般状况和关节肿胀的变化,同时从整体角度,动态观察了MSCs治疗前后实验动物外周血象变化;血清中IL-1、TNF-a及TGF-β1等细胞因子的变化,从局部角度观察了MSCs在受损关节局部滑膜、软骨区的趋化和聚集,以及对受损关节局部滑膜、软骨破坏的保护和修复作用。实验结果提示异基因MSCs移植治疗方法是安全的,并可有效改善RA实验动物的关节肿胀症状。经局部关节滑膜、软骨组织病理切片,BrdU和OPG（骨保护素）免疫组化结果显示,在受损关节滑膜、血管内膜及软骨中均可见大量棕黄色颗粒的BrdU阳性细胞,而正常关节滑膜处棕黄色颗粒出现BrdU阳性细胞数相对较少,同时MSC治疗组关节滑膜中OPG阳性率增加。说明经外周静脉输入的MSCs可集中趋化到实验动物炎症损伤部位,阻止局部组织损伤。并对模型鼠机体免疫紊乱状态起调节作用。MSCs在类风湿关节炎大鼠模型移植治疗有效的研究结果,为利用MSCs的免疫调节和损伤修复特性治疗类风湿关节炎的临床应用提供了有价值的实验基础。在第三部分的研究中,我们在上两部分的实验结果基础上,进一步观察了1例,利用脐带血间充质干细胞治疗的类风湿关节炎病人。初步观察了临床应用的安全性和治疗效果。结果显示输注脐带血间充质干细胞过程顺利,输注过程中以及输注后均无发热、皮疹、寒战等变态反应出现。单用MSCs输注后患者关节疼痛症状减轻、血沉下降、类风湿因子转阴、T细胞亚群恢复。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 研究背景
• 技术路线
• 第一部分 骨髓间充质干细胞调节类风湿关节炎患者免疫机制体外研究
• 引言
• 技术路线
• 实验一、类风湿关节炎骨髓间充质干细胞生物学特性的研究
• 材料和仪器
• 方法
• 结果
• 讨论
• 实验二、异基因骨髓间充质干细胞对类风湿关节炎患者T、B细胞的影响
• 材料和仪器
• 方法
• 结果
• 讨论
• 实验三、骨髓间充质干细胞对类风湿关节炎患者主要细胞因子的影响
• 前言
• 材料和仪器
• 方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第一部分附图
• 第二部分 骨髓间充质干细胞治疗类风湿关节炎疗效和机理的动物实验研究
• 引言
• 研究目标
• 实验流程
• 实验一 正常大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定
• 材料和仪器
• 方法
• 结果
• 讨论
• 实验二、类风湿关节炎大鼠模型的制作
• 材料与仪器
• 方法
• 结果
• 讨论
• 实验三、骨髓间充质干细胞治疗类风湿关节炎的机理和疗效
• 材料与仪器
• 方法
• 结果
• 讨论
• 本部分小结
• 参考文献
• 本部分附图
• 第三部分 利用间充质干细胞治疗类风湿关节炎的临床研究
• 引言
• 实验一、人脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定
• 材料和仪器
• 方法
• 结果
• 讨论
• 实验二、脐带血间充质干细胞治疗类风湿关节炎的临床研究
• 前言
• 材料和仪器
• 方法
• 结果
• 讨论
• 本部分小结
• 参考文献
• 本部分附图
• 本课题的结论
• 综述一 类风湿关节炎发病机制研究进展
• 综述二 骨髓间充质干细胞的生物学特性及其在免疫治疗中的应用
• 个人简历
• 致谢