嗜热菌Thermus thermophiles HB8丙酮酸脱氢酶的表达及其酶动力学测定

论文摘要

嗜热酶（thermozymes）是嗜热菌（thermopHiles）体内的一种热稳定性酶,其能够适应自然界中较高的温度条件并能在该恶劣环境中保持良好的生理状态。由于嗜热酶所具有的这种特性,其可以在许多依赖高温条件的工业生产过程中替代常规的、不耐热的化学试剂和常温酶,从而提高酶促反应速度,降低微生物污染的危险性,这些特点让这种酶在大规模工业生产中有更广阔的应用范围和更低的成本投入、更高的回报比例,因此这方面的研究具有可观的经济前景。本实验所研究的目的蛋白丙酮酸脱氢酶（E1蛋白）即是这样一种重要的嗜热酶。通过催化丙酮酸的氧化脱羧从而为三羧酸循环和激素合成输送乙酰辅酶A,丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）在糖代谢中扮演了一个非常关键的角色。E1为PDC的重要组成部分,它催化了整个反应体系中非常关键的第一步。本论文实验以嗜热菌thermos thermopHiles HB8为材料,通过PCR技术扩增大肠杆菌丙酮酸脱氢酶（E1）基因,并将目的基因分别连接到克隆载体pGEM-T和表达载体pTrcHisC上,构建重组质粒。重组质粒pTrcHisC-E1在大肠杆菌中于20～25℃的温度下诱导4～6小时表达。利用Ni-NTA金属亲和层析的方法从总蛋白中提取E1蛋白,然后通过透析超滤管浓缩获得纯度、浓度较高的E1蛋白溶液,最后采用铁氰化钾法对其进行酶动力学测定。本实验成功构建了表达丙酮酸脱氢酶基因的载体,诱导表达并纯化出了具有酶反应活性的丙酮酸脱氢酶,经过酶动力学测定得到该嗜热菌E1的下列酶活性数据:其最适反应温度大约为76℃,最适反应pH值大约为8.5,Vmax为278mol/（L.min）,Km值为2.04mmol/L。本实验所取得的数据和经验拓展了丙酮酸脱氢酶研究的物种范围,扩充了嗜热酶的研究种类和研究方法,为将来进一步对丙酮酸脱氢酶系和嗜热菌生理功能的研究奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 绪论
• 1.嗜热酶
• 1.1 嗜热酶的结构特性
• 1.1.1 嗜热酶自身的结构特点
• 1.1.2 嗜热酶结构以外的因素
• 1.2 嗜热酶的应用前景
• 2.丙酮酸脱氢酶结构与功能
• 2.1 丙酮酸脱氢酶复合体的结构及功能
• 2.2 丙酮酸脱氢酶的功能调控
• 2.2.1 E1调节机制的磷酸化位点特异性
• 2.2.2 E1调节机制的多PDK、PDP同工酶特性
• 第二部分 材料与方法
• 1.实验材料
• 1.1 菌株和质粒载体
• 1.2 工具酶及主要试剂
• 1.3 实验所用溶液及其配制
• 1.4 主要设备仪器
• 2.实验方法
• 2.1 实验流程技术路线
• 2.2 E1的克隆和表达载体的构建
• 2.2.1 嗜热菌Thermus.thermopHilus HB8基因组的提取
• 2.2.2 基因组DNA鉴定
• 2.2.3 E1基因的扩增和产物纯化回收
• 2.2.4 T-A克隆及重组质粒DNA序列测定
• 2.2.5 重组表达载体构建
• 2.2.6 T4 DNA Ligase连接pGEM-T-E1和pTrcHisC
• 2.3 E1的纯化和酶动力学数据测定
• 2.3.1 蛋白的诱导表达
• 2.3.2 细菌的破碎
• 2.3.3 蛋白的亲和层析
• 2.3.4 蛋白的透析
• 2.3.5 蛋白的浓缩
• 2.3.6 蛋白的酶活测定
• 第三部分 结果与分析
• 1.电泳检测基因组DNA结果
• 2.PCR扩增E1基因
• 3.重组质粒pGEM-T-E1的PCR法快速鉴定阳性克隆
• 4.重组质粒pGEM-T-E1的酶切
• 5.重组质粒pTrcHisC-E1的克隆和鉴定
• 6.E1的亲和层析纯化
• 7.E1的酶动力学
• 7.1 温度梯度
• 7.2 缓冲液PH梯度
• 7.3 底物浓度梯度
• 第四部分 讨论
• 1.蛋白纯化中的各类问题
• 2.酶动力学测定
• 3.结果和展望
• 参考文献
• 致谢