论文摘要
研究背景肾母细胞瘤（nephroblastoma）是小儿外科常见的恶性、实质性肿瘤。预后好于其它肿瘤。自90年代以来，肿瘤手术切除率近于100％，5年生存率达到80％，早期诊断并行手术切除可明显提高患儿长期生存率。术后复发是影响生存率的重要因素。实践已证明，许多术后复发、转移的肾母细胞瘤患儿，如果能够及早发现，及时治疗，部分病例可达到临床治愈、长期存活的疗效。故对于小儿恶性实体瘤的术后随访十分重要，这对于早发现肿瘤的复发转移、及时治疗、提高生存率有重要意义。目前对其术后监测主要依靠临床症状和超声检查、CT、泌尿系平片、静脉肾盂造影等影像学手段，但这些检查手段只有当肿瘤长到一定大小时才能被发现，敏感性差。此外，当前尚未发现肾母细胞瘤诊断特异性强的生物学标记物。因此，探索一种简单、快速、敏感性高和特异性强的肾母细胞瘤预后监测的新方法具有重要的临床意义。肾母细胞瘤的发生是多基因多阶段多因素的动力学过程，是癌基因激活和抑癌基因失活的结果，涉及到多个基因，基因突变或调控异常时，细胞内的蛋白质在成份和数量上都会有相应的改变，通过对蛋白质的动态观察可以了解肿瘤是否复发或转移的动态变化。蛋白质组学的发展为肿瘤预后监测提供了新的思维和技术平台。表面增强激光解吸电离化飞行时间质谱（Surface Enhanced LaserDesorption／Ionizayion Time of Flight-Mass Spectrometry，SELDI-TOF-MS）技术是近年开发的新型蛋白组学技术，应用基因芯片的设计原理，把层析、质谱等技术合理地与蛋白质芯片结合，可检测出传统方法难以鉴定的蛋白质和多肽，是发现蛋白质标记物的理想方法，具有快速、灵敏、高通量等特点。我们利用SELDI-TOF-MS技术检测肾母细胞瘤患儿术前术后血清蛋白质标记物的表达差异，探索肾母细胞瘤患儿预后监测的新方法。研究目的检测肾母细胞瘤患儿术前术后血清蛋白质标记物的表达差异，探索肾母细胞瘤患儿预后监测的新方法。材料与方法1．临床资料血清标本100例均来自郑州大学第一附属医院小儿外科，其中肾母细胞瘤术前标本30例、术后2周24例（行根治术21例，行姑息切除术3例）、术后3个月和6个月各23例。30例肾母细胞瘤标本均经2位以上病理学医师证实。其中男16例，女14例。年龄24天～10岁，平均2.8±0.1岁；术前术后对比研究的24例患儿中男13例，女11例，平均年龄2.6±0.1岁，术前均未接受放化疗。门诊体检的健康小儿20例作为正常对照组。与患儿年龄性别相配对。外周静脉血标本均于清晨空腹时抽取，静置1h后3000 rpm离心10 min，收集血清样本，分装储存于-80℃保存。2．主要试剂和仪器CHAPS缓冲液，尿素，DTT，醋酸钠缓冲液，SPA（Sinapinic acid）均购自美国Sigma公司。蛋白芯片生物系统（Ciphergen PBSⅡ+SELDI -TOF-MS）和弱阳离子交换芯片WCX2均购自美国Ciphergen Biosystems公司。3．实验步骤血清标本冰浴解冻，4℃离心；取96孔板置冰盒上，每孔加U9（9 MUrea，2％CHAPS，1％DTT）10 ul，血清5 ul，4℃层析柜600 r／min振荡30 min。震荡结束前15 min做芯片预处理，芯片装入Bioprocessor中，记录芯片号；每孔加醋酸钠（100mmol／L，pH4）200 ul，层析；U9处理后的96孔板置冰上，排枪加醋酸钠185 ul，层析；取已处理的样本100 ul加入到芯片上，层析，甩去残液，快速拍干。加醋酸钠200 ul，振荡，甩掉，拍干。200 ul去离子水200 ul冲洗、甩干。芯片风干后，每孔分两次加入50％饱和SPA 1 ul，干燥后上机待测。4．数据收集与处理用已知分子量的蛋白芯片将SELDI-TOF-MS系统校正到分子量误差＜0.1％。将结合好蛋白质的WCX2蛋白质芯片用质谱阅读仪分析。分析参数：激光强度为170，灵敏度为6，每个样本收集总点数140次。收集数据范围1000～30000，优化范围2000～20000。以质控血清作重复性检测，其峰值大小和强度变异系数为0.05％和19.7％。数据用Proteinchip Software 3.1校正。ZUCI-ProteinChip Data Analyze System软件包分析，离散小波分析去除噪音，减掉基线。用局部极值的方法找出样本各自的峰，并过滤掉信噪比小于2的峰。以10％为最小阈值做聚类分析，将各个样本中m／z的差异小于0.3％的峰聚为一类。支持向量机分类器设置：采用径向基核函数，Gamma值设为0.6，罚分函数（C）设为19。特征向量的选择采用统计过滤结合模型依赖性筛选方法，建立判别模型，用留一法交叉验证评估模型的判别效果。采用判别分析方法处理质谱数据对经S处理得到的结果进行验证。5．统计学处理质谱原始数据经过滤噪音，聚类分析处理后，对初步筛选出的质荷比峰数据做Wilconxon秩和检验，并分别对患儿术前与正常对照组、手术前后、术后与正常对照组的质谱数据进行t检验。检验标准取α=0.01。结果1．肾母细胞瘤患儿与正常对照组比较30例术前标本和正常对照组标本的质谱数据经初步过滤筛选得到352个m／z峰，对其相对强度做Wilconxon秩和检验分析，P值＜0.01的m／z峰11个，从差异显著蛋白质峰的任意组合中，采用SVM筛选出预测值的youden指数（阳性率与阴性率之差）最高的组合模型，筛出m／z峰值位于6984.5和6455.5的蛋白质标志物2个，患儿组此2峰处的蛋白质表达强度分别为299.7±134.6、1036.9±375.9，正常对照组表达强度分别为731.6±277.9、1799.3±556.7，2组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。联合两个潜在标记物作为输入值，留一法交叉检测，在测试集上判别模型的特异性为100％，敏感度为100％。2．肾母细胞瘤患儿术后与术前、正常对照组的比较与术前比较，术后2周24例标本2种蛋白质标记物表达均升高。19例根治术后标本2种蛋白质表达为702.7±198.2、1723.5±438.6，与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；2例疑转移但行局部根治术和3例行姑息性切除患儿标本表达为358.1±213.3、1107.9±402.2，与正常对照组比较表达降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。术后3、6个月跟踪复查时，19例根治术后患儿标本表达分别为719.3±153.7、1708.4±213.8和711.4±203.5、1756.3±377.2，与术前相比呈高表达（P＜0.01），与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），余5例（1例于术后2月死亡）术后3、6个月标本分别为335.9±114.2、535.9±204.0和238.6±53.5、411.3±167.2，与术前相比呈低表达，差异无统计学意义（P＞0.05），与正常对照组比较呈持续低表达，差异有统计学意义（P＜0.01），与术后2周相比表达又有所降低，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论1．m／z位于6984.5、6455.5的蛋白质构成的血清蛋白质指纹图谱模型对肾母细胞瘤预后监测具有很好的应用价值。2．运用SELDI-TOF-MS技术结合生物信息学方法检测肾母细胞瘤患儿手术前后血清蛋白质标记物的差异，构建用于监测手术效果、预测肿瘤复发的血清蛋白质指纹图谱模型，为肾母细胞瘤术后患者预后判断提供一种可能的新方法。