论文摘要
自发现青霉素以来,抗生素一直是人类治疗病原微生物感染疾病的有力武器,但随着抗生素的长期广泛应用,病原菌耐药性的形成日趋严重,因此迫切需要开发新型抗生素,目前从微生物中寻找新生物的难度已愈来愈大。抗菌肽的发现为开发新型抗生素提供了广阔的来源。抗菌肽（antibacterial peptide）是生物体内经诱导产生的一类具有生物学活性的小分子多肽,广泛存在于多种生物体中,是宿主免疫防御系统的一个重要组成部分,由于其独特的抗菌机制,不会诱发细菌的耐药性,成为具有巨大发展潜力的新型抗菌药物。抗菌肽从天然资源中提取成本高、得率低、工序繁琐;化学合成则价格相当昂贵,也难以应用于临床,利用基因工程技术生产抗菌肽具有重要意义。由于抗菌肽基因一般都较小,故采用人工合成的方法来获取目的基因,再通过基因工程方法进行微生物发酵生产更具有实际意义。本研究的目的就是应用基因工程和蛋白质工程技术研制出重组人源抗菌肽LL-37,并研究其体内外抗菌活性,为重组抗菌肽的工程化生产及其在临床上的应用奠定基础。本研究主要从以下几个方面展开。1选取Genbank中的LL-37抗菌肽序列,并根据毕赤酵母偏好密码子设计并人工合成人源抗菌肽LL-37基因,全长141bp。基因N端引入α-交配信号肽Kex2裂解位点,以保证抗菌肽分泌表达后具有天然N端;C端引入谷氨酰胺增加抗菌肽的酰氨化程度,以增强广谱抗菌活性。此外,基因的两端分别引入两个限制性酶切位点XhoⅠ和XbaⅠ。抗菌肽基因被克隆入pPICZα-A质粒,成功构建了分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-LL-37。将重组质粒SacⅠ线性化后电击转化Pichia pastoris X-33。在AOX1（醇氧化酶）启动子调控下,类似天然抗菌肽大小的目的蛋白获得分泌表达。初步抑菌活性测定显示其对金黄色葡萄球菌（CowanⅠ）、致病性大肠杆菌和鸡白痢沙门氏菌均具有很强的抑杀活性。2对LL-37重组酵母菌的摇瓶发酵条件进行了表达优化和生物学活性研究,结果显示当含有重组酵母菌的BMGY培养液OD600达到5～6时转接pH值为6.0 BMMY培养基,每24h补加1%甲醇,28℃培养96h后,抗菌肽LL-37可获得高效表达。根据琼脂孔扩散法,对重组抗菌肽的酸、碱、热稳定性等生物学特性进行检测。酸碱稳定性实验结果显示,所表达的重组抗菌肽在pH 2.0～12.0时均具有一定的活性,pH5.0～6.0时活性最好。热稳定性实验显示,重组抗菌肽121℃加热21min、100℃加热3h仍有较好的活性。保存期试验结果显示:-20℃条件下保存活性较好。基于这样的特性该抗菌肽有望在饲料和食品添加剂中得到很好的应用。3以普通14日龄雏鸡为研究对象,初步研究了重组抗菌肽LL-37三种剂型对雏鸡生产性能的影响及其对雏鸡预防大肠杆菌感染的保护实验。通过预试验,初步确定了选用的大肠杆菌对雏鸡的最小致死剂量(MLD100)。通过连续28天对雏鸡饮水给药,每周测定雏鸡增重、料重比,攻毒后测定死亡率、保护率和康复率,进而比较其与抗生素在以上指标上的差异。结果表明:用药一周后,（LL-37+cecropin P1）上清组与对照组相比,增重显著升高（P＜0.01）;用药二周后,抗菌肽LL-37各剂型组与对照组相比,增重显著升高（P＜0.01）;用药三周、四周后,壳聚糖载药微囊液组增重显著升高（P＜0.05）。用药一周、二周、三周和四周后,抗菌肽LL-37各剂型组与各对照组相比,料重比显著降低（P＜0.01）。对雏鸡攻毒致病性大肠杆菌后,抗菌肽LL-37各剂型组、环丙沙星组与感染对照组相比,死亡率显著降低（P＜0.01）;抗菌肽LL-37各剂型组对雏鸡的保护和防病效果要优于环丙沙星组。4以普通21目龄肉雏鸡为研究对象,初步研究了重组抗菌肽LL-37治疗雏鸡大肠杆菌感染的效果。通过预试验,初步确定了选用的大肠杆菌对雏鸡的最小致死剂量(MLD100)。治疗实验中,在最小致死剂量大肠杆菌腹腔注射24 h后,口服不同剂型的抗菌肽LL-37,连续治疗5天。结果表明,重组抗菌肽LL-37对大肠杆菌有较好的体内治疗效果。其中（LL-37+cecropin P1）上清组的效果最佳,其治疗效果与兽用盐酸环丙沙星相当;抗菌肽治疗组,环丙沙星与感染对照组相比,死亡率显著降低（P＜0.05）;LL-37上清组和壳聚糖载药微囊液组的治愈率较环丙沙星组差。