论文摘要
神经元是大脑神经系统结构和功能的基本单位,包括胞体和突起两部分,而突起又可以分为轴突和树突。树突发育早期首先从胞体上萌发出树突丝,当条件成熟时树突丝发育成树突棘,随后树突棘参与突触的形成,可见树突发育是脑发育的重要过程,它的结构和特性决定了突触信息的传递效率。RhoA. Rac1和Cdc42是与树突结构发育密切相关的上游分子,其中Rho A负向调控轴突和树突的生长,而Rac1和Cdc42对轴突和树突的向外生长至关重要,诱导富含激动蛋白的表面形成伪足或丝足,并调控神经元树突丝的运动性。脑内雌激素可通过雌激素受体（Estrogen Receptor, ER）对脑发育产生重要影响,包括神经回路的形成、树突的延伸和分支、突触形成、神经递质和神经肽的表达以及细胞凋亡和存活。双酚A（Bisphenol A, BPA）是一种环境内分泌干扰物,具有类雌激素活性和抗雌激素活性,通过与雌激素受体结合干扰内源性雌激素活动。由于内源性雌激素影响树突发育和突触发生,因此,我们推测具类雌激素活性的BPA可干扰雌激素活性影响树突的结构发育。兴奋性氨基酸NMDA受体是一种既受膜电位控制又受神经递质控制的双门控通道,在突触的传递、突触可塑性的调控,以及学习记忆过程中具有重要作用,是中枢神经系统中最重要的受体之一,在大脑中大量表达。雌激素与膜雌激素受体结合后可激活NMDA受体,从而调节树突发育和突触可塑性。MAPK/ERK信号通路是脑内重要的信号通路,其中ERK对海马神经元树突结构的形成与变化具有调控作用。同时研究发现雌激素能激活ERK2/MAPK信号转导通路,在大鼠动情周期中,ERK2的活性水平随雌激素水平的改变而改变。综上,本研究通过体外培养海马神经元BPA慢性暴露,观察BPA对海马神经元树突结构的发育影响,同时应用雌激素受体拮抗剂、NMDA受体拮抗剂和MEK1/2抑制剂探索BPA影响树突发育的可能机制。方法：用携带GFP基因的腺病毒（Adv-EGFP）感染体外培养五天的海马神经元细胞,48h后观察海马神经元树突形态动力学变化。实验分为对照（DMSO）、E2（10nM）和BPA（1nM、10nM、100nM）5个组。体外培养第6d加入药物,24h后在荧光显微镜下观察神经元细胞并进行活细胞成像,细胞样品每隔2min拍摄一张照片,20min后得一组11祯照片,叠加后观察树突丝动态性。用Image-Pro Plus 5.0图像软件测量树突丝运动性、树突丝密度和树突分支总长。为了进一步探索雌激素受体、NMDA受体和ERK1/2通路是否参与海马神经元树突结构发育,分别用10μM的雌激素受体拮抗剂ICI 182,780、NMDA受体拮抗剂MK-801和MEK1/2抑制剂U0126预处理细胞0.5 h,然后加入BPA（100nM）染毒,同时设对照组（DMSO）、BPA（100nM）单独染毒组和E2（10 nM）,然后再观测神经元树突运动性变化。为进一步分析BPA影响树突丝发育的分子机制,采用Western Bloting法检测与树突发育相关的上游分子：RhoA、Rac1/Cdc42的表达,并通过雌激素受体拮抗剂、NMDA受体拮抗剂和MEK1/2抑制剂的使用分析雌激素受体、NMDA受体和ERK1/2是否参与BPA对树突发育相关的上游分子表达的影响；最后,用免疫细胞化学法检测BPA是否改变NMDA受体NR1、NR2B亚基及其磷酸化水平,以及β-雌激素受体（Estrogen Receptor beta, ERB）表达。用Quantity one软件测定蛋白条带光密度值,用Image-Pro Plus 5.0分析测定免疫细胞化学图片。最后实验数据采用SPSS15.0统计软件中的One-way ANOVA法分析,进行t检验, P<0.05作为具有统计学差异显著性。结果：1.BPA（10～100nM）慢性暴露24h显著增加树突丝的运动性（P<0.001）,增加树突丝密度（P<0.001）和树突分支总长（P<0.05,P<0.01）,作用趋势与E2组相同。雌激素受体拮抗剂（ICI 182,780）、NMDA受体拮抗剂（MK-801）和MEK1/2抑制剂（U0126）,均可抑制BPA对树突形态发育的影响（P<0.05,P<0.01或P<0.001）。2.BPA（10～1000nM）显著上调Rac1/Cdc42蛋白的表达（P<0.01或P<0.001）,下调RhoA蛋白的表达（P<0.05或P<0.01）。ICI 182,780和MK-801可显著抑制BPA（100nM）对Rac1/Cdc42的上调作用（P<0.01或P<0.05）,而ICI 182,780、MK-801和U0126均可显著抑制BPA（100nM）对RhoA的下调作用（P<0.01）。3.BPA（100nnM）可显著上调ERβ蛋白的表达（P<0.001）,同时该效应可被ICI 182,780和U0126抑制（P<0.001）。4.BPA（100nM）显著下调NMDA受体亚基NR1和NR2B的表达（P<0.01或P<0.001）,该作用可被ICI 182,780和U0126显著抑制（P<0.01或P<0.05）。同时BPA（100nM）显著上调磷酸化NR1和磷酸化NR2B的表达（P<0.05）,ICI182,780对该作用有抑制（P<0.05）。结论：BPA慢性暴露可通过影响树突形态发育相关上游分子Rac1/Cdc42和RhoA而增加体外培养海马神经元树突丝密度和运动性以及树突分支总长；这一过程可能由雌激素受体介导,通过ERK1/2信号通路激活树突表面NMDA受体,再经树突发育相关的上游分子（RhoA、Racl、Cdc42）,最终影响树突形态。
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标签：双酚论文; 海马神经元论文; 树突结构发育论文; 雌激素受体论文; 甲基天冬氨酸受体论文;