奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌相关毒力因子的研究

论文摘要

本实验对奶牛乳腺炎阳性和阴性乳汁进行细菌分离,用金黄色葡萄球菌的特异性检测引物检测出金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌溶血素是一种外毒素,是其主要毒力因子之一,包括α、β、γ和δ毒素。溶血素对多种哺乳动物红细胞有溶血作用,并可作用于平滑肌细胞,引起乳腺平滑肌收缩、麻痹,引发牛的坏疽性乳腺炎。本实验设计双重PCR方法,检测山东省内20多个规模化奶牛场乳腺炎病例中分离得到的金黄色葡萄球菌,实验发现:80%以上的金葡菌存在α溶血素基因,基因片断长704bp;而β溶血素基因比例为59%,片断大小为496bp。检测金黄色葡萄球菌粘附素基因Fnbp A和Fnbp B,分析奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌临床分离株纤连蛋白连接蛋白主效基因。利用设计合成的特异性引物对金黄色葡萄球菌进行PCR扩增,对本实验室所分离鉴定的金葡菌临床分离株进行双重PCR检测。PCR产物经过电泳成像显示,分别在524bp和642bp处出现特异性条带。通过对金葡菌临床分离株双重PCR检测发现:95%以上的金葡菌存在粘附素基因Fnbp A,而Fnbp B基因仅有10%。血浆凝固酶是检验致病性金黄色葡萄球菌的重要指标,它们能使含有抗凝剂的家兔或人的血浆凝固,有助于致病菌抵御宿主体内吞噬细胞和杀菌物质的作用。依据金黄色葡萄球菌血浆凝固酶基因序列,设计合成特异性引物,通过聚合酶链式反应扩增其基因,并将扩增基因克隆入T载体,进行序列测定,对所分离的奶牛乳腺炎病原菌进行鉴定。结果显示:金黄色葡萄球菌扩增出特异性条带,大小为761bp;其他菌株未出现条带。金黄色葡萄球菌Fnbp的抗体不仅可以阻止细菌的黏附,而且还是一种调理素,可以促进机体对细菌的清除作用。金黄色葡萄球菌的α-溶血素是一种胞外毒素,其类毒素对金黄色葡萄球菌所致的羊乳腺炎有部分保护作用。本实验利用获得的基因工程蛋白rFnbp、rα-HL及真核表达质粒pcDNA3.1+-ClfA,混合佐剂免疫实验小鼠,通过ELISA方法检测血清中的抗体水平。结果发现:所有蛋白疫苗免疫实验小白鼠在首免后所采集的血清中均检测到了特异性抗体,通过初步金黄色葡萄球菌攻毒实验,证实制成的基因工程蛋白亚单位疫苗能使小鼠对金葡菌的感染率和死亡率降低,为金黄色葡萄球菌的防治提供一条新途径。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 综述 引起奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌的毒力因子研究进展
• 1 奶牛乳腺炎概述
• 2 金黄色葡萄球菌的生物学特性及其主要毒力因子
• 3 金黄色葡萄球菌疫苗的相关研究进展
• 正文
• 前言
• 第一部分 奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌的分离、鉴定及其毒力因子的检测
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 分析与讨论
• 第二部分 重组Α-溶血素及FNBP A 蛋白基因工程疫苗免疫实验
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 分析与讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表文章