重组α-环糊精葡萄糖基转移酶酶制剂稳定性的研究

论文摘要

环糊精葡萄糖基转移酶（简称CGT酶,EC 2.4.1.19）能够通过分子内转糖苷反应将淀粉及淀粉类似物转化为环糊精。由于环糊精能与客体分子形成包含复合物,改变客体分子的物理和化学性质,因而在食品、医药和化妆品等领域的应用越来越广,CGT酶已成为当今研究的热点。本实验室前期的研究工作中,成功实现了Paenibacillus maceransα-环糊精葡萄糖基转移酶（α-CGT酶）在大肠杆菌中的胞外分泌表达。但研究中我们发现无论是天然α-CGT酶还是重组酶酶制剂的热稳定性均较差,不利于规模化的工业应用。为了提高重组α-CGT酶的稳定性,本研究从基因水平、大分子化学修饰水平和改变酶分子微环境水平三个方面对α-CGT酶的热稳定性开展了研究。此外,用圆二色光谱（CD）分析了α-CGT酶的热稳定性与其天然结构之间的关系,并对多羟基化合物对酶分子的稳定机理做了初步研究。主要研究结果如下：（1）纯化了来源于P. macerans的天然α-CGT酶以及来源于Escherichia coli和Bacillus subtilis的重组酶,经热处理后发现来源于P. macerans, E. coli和B. subtilis的α-CGT酶残酶活分别为28%,30%和25%。可见,来源于不同菌种的α-CGT酶的热稳定性相似,若直接使用,均不能达到工业用酶制剂的要求。根据三种菌对α-CGT酶的产量,最终确定将来源于E. coli的重组α-CGT酶作为本课题后续的研究对象。（2）分析了重组α-CGT酶的最适贮存pH和贮存蛋白浓度。结果显示pH6.5,蛋白含量为4 mg/mL的α-CGT酶热稳定性最好。将蛋白含量为4 mg/mL, pH 6.5的粗酶制剂分别在4℃、25℃和37℃贮存。当酶液在4℃和25℃贮存时,T1/2分别为108 d和50 d,在37℃贮存时α-CGT酶的酶活很快下降,T1/2为2.9 d,一周后酶活完全丧失。（3）采用定点突变技术研究了盐桥对提高重组α-CGT酶热稳定性的影响。对突变体的研究表明,单突变酶CGTM-1（K192R）热稳定性较未突变的没有太大提高;突变三个氨基酸后的突变酶CGTM-3（T185S/I186Y/K192R）热稳定性有了明显提高。在50℃水浴30min后突变酶CGTM-3残酶活是对照的两倍多。将蛋白含量为4 mg/mL, pH 6.5的突变酶CGTM-3粗酶制剂分别在4℃、25℃和37℃贮存,定时取样测酶活,得出其T1/2分别为120 d、80 d和7 d。（4）采用戊二醛交联的方法研究了化学修饰对提高重组α-CGT酶稳定性的影响。α-CGT酶经戊二醛交联成大分子聚合物后,50℃水浴30 min发现与对照相比酶的热稳定性有所提高,但是交联过程中酶活损失了50%。后用α-CGT酶粗酶液进行交联,虽然交联过程酶活损失有所降低,酶的稳定性也有所提高,但仍不能满足工业化应用要求。（5）采用向α-CGT酶液中添加化学添加剂研究了酶分子微环境的改变对提高重组α-CGT酶的稳定性的影响。当单独加入各种保护剂在50℃水浴1 h和室温放置108 d后,发现含有20%甘油的酶液稳定性最好,与未加任何添加剂的对照酶液相比仍有91%和50%的酶活,对照酶液在50℃水浴1 h后仅有小于10%的活性,室温放置108 d后已经没有酶活。明胶、CaC12和PEG400也有一定的保护效果。将四种保护剂分别以最佳浓度组合叠加添加到α-CGT酶发酵液中40℃贮存45 d,发酵液中α-CGT酶的残酶活几乎不变,维持在100%左右。采用圆二色谱（CD）研究不同条件下酶的热稳定性变化与蛋白质构象变化之间的关系。发现保护剂有利于维持酶天然三维构象,明显降低高温条件下α-CGT酶的变性程度,使酶在高温时仍保持较高的酶活。此外,通过不同分子量的PEG和甘油对α-CGT酶保护效果的研究发现,多羟基化合物的羟基含量可能是影响α-CGT酶分子热稳定性的重要因素。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 环糊精概述
• 1.1.1 环糊精的组成与结构
• 1.1.2 环糊精的功能与应用
• 1.2 环糊精葡萄糖基转移酶（CGT酶）概述
• 1.2.1 CGT酶的三维结构
• 1.2.2 CGT酶的功能
• 1.2.3 CGT酶的应用
• 1.3 CGT酶稳定性的国内外研究现状
• 1.4 提高酶分子稳定性的研究概况
• 1.5 课题研究的目的和意义
• 1.6 主要研究内容
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 质粒和菌株
• 2.2 试剂与仪器
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 主要仪器
• 2.3 培养方法
• 2.3.1 培养基
• 2.3.2 种子培养
• 2.3.3 摇瓶发酵
• 2.4 分子生物学操作
• 2.4.1 突变体的构建与转化
• 2.4.2 E. coli电转化感受态细胞的制备
• 2.4.3 电击转化
• 2.4.4 质粒DNA的提取
• 2.4.5 质粒DNA的酶切验证
• 2.4.6 DNA琼脂糖凝胶电泳
• 2.5 分析方法
• 2.5.1 α-CGT酶粗酶液的制备
• 2.5.2 蛋白质浓度的测定
• 2.5.3 α-CGT酶环化活力的测定
• 2.5.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测表达产物
• 2.5.5 α-CGT酶的纯化
• 2.5.6 不同来源的纯化α-CGT酶热稳定性比较
• 2.5.7 α-CGT酶最适贮存浓度和pH的选择
• 2.5.8 突变α-CGT酶的结构模拟
• 2.5.9 α-CGT酶的化学修饰
• 2.5.10 α-CGT酶保护剂的筛选及浓度优化
• 2.5.11 α-CGT酶粗酶液长期贮存情况研究
• 2.5.12 保护剂对α-CGT酶长期贮存保护效果的研究
• 2.5.13 α-CGT酶的热稳定性与其结构变化的研究
• 2.5.14 甘油提高α-CGT酶热稳定性机理的初步研究
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 不同来源α-CGT酶稳定性研究
• 3.1.1 不同来源α-CGT酶粗酶制剂的稳定性
• 3.1.2 不同来源的α-CGT酶的纯化
• 3.1.3 不同来源的纯化α-CGT酶的热稳定性比较
• 3.1.4 pH和蛋白浓度对α-CGT粗酶制剂稳定性的影响
• 3.1.5 温度对α-CGT酶粗酶制剂贮存稳定性的影响
• 3.2 定点突变形成盐桥对重组α-CGT酶稳定性的影响
• 3.2.1 重组α-CGT酶的定点突变
• 3.2.2 重组α-CGT酶和突变α-CGT酶的表达
• 3.2.3 重组和突变α-CGT酶的热稳定性比较
• 3.2.4 盐桥与α-CGT酶热稳定性的相关性
• 3.3 化学修饰对重组α-CGT酶稳定性的影响
• 3.3.1 纯化重组α-CGT酶的戊二醛交联及其稳定性分析
• 3.3.2 重组α-CGT酶粗酶液的戊二醛交联及其稳定性分析
• 3.4 化学添加剂对重组α-CGT酶稳定性的影响
• 3.4.1 化学添加剂的筛选
• 3.4.2 化学添加剂对酶制剂贮存稳定性的影响
• 3.4.3 α-CGT酶天然构象与热稳定性之间的相关性
• 3.4.4 甘油提高α-CGT酶热稳定性的机理
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文