拟南芥WUSCHEL和AGAMOUS-Like 15基因的克隆及对烟草的转化

论文摘要

植物体细胞胚发生是植物细胞全能性的重要体现,在适宜的培养条件下能够以较高的频率再生出完整的植株,是植物遗传改良受体系统。体细胞胚发生一般经历一个脱分化过程,即由营养生长的体细胞转变成生殖生长的胚性细胞。许多体细胞胚发生相关基因在合子胚中也有相似的表达方式,预示体细胞胚发生与合子胚发生可能存在相似的基因表达调控方式。因此,开展体细胞胚发生的基因表达调控研究对认识植物细胞分化和合子胚发生发育的分子机理具有重要的理论意义。本研究在充分查阅国内外植物合子胚和体细胞胚发生相关基因资料的基础上,初步确定了一批候选基因,如AtSERK1、PIN1、PIN7、MP、LEC2、WUS、AGL15和BBM等,但是如果这些胚胎发生相关基因在转化细胞中持续过量表达,往往导致转化细胞无法分化或产生畸形苗,影响转基因的遗传转化效率和转基因植株的遗传改良效果。质粒载体PINDEX3是一个地塞米松诱导的表达调控系统,在转录水平上非常严谨地调控外源基因的表达,已经成功地运用到拟南芥、烟草、水稻等多种植物中。因此,我们将扩增出WUS和AGL15基因连接到PINDEX3中,构建出它们的地塞米松诱导表达调控体系,通过调控诱导剂来实现WUS和AGL15基因在转化细胞内限时定量表达,并初步研究了它们在烟草再生中的作用,所得结果如下:1运用RT-PCR技术从拟南芥中扩增出WUS和AGL15基因。经测序发现,扩增的WUS基因与已报导的序列（NM127349）完全一致,而扩增的AGL15基因与已报导的序列（NM121382）发生了一个碱基突变,它的开放阅码框的第563个碱基由报导的A突变成G,相应的编码氨基酸由天冬氨酸变成甘氨酸。2构建了植物诱导表达载体pIWUS（WUS基因）和pIAGL15（AGL15基因）,并将它们导入农杆菌GV3101中,通过叶盘法获得抗潮霉素的烟草植株,经PCR检测分别获得转WUS基因的阳性植株12个株系（共检测86个株系）和转AGL15基因的阳性植株6个株系（共检测34个株系）。3在未加地塞米松诱导剂的情况下,转基因植株（WUS和AGL15）并没有表现出异常的表型变化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 植物胚胎发生的基因表达调控
• 1.2 植物体细胞胚发生的研究进展
• 1.2.1 植物体细胞胚发生的特点
• 1.2.2 植物体细胞胚发生的影响因素
• 1.2.3 植物体细胞胚发生的的基因表达调控
• 1.3 拟南芥WUS（WUSCHEL）基因的研究进展
• 1.4 拟南芥AGL15（AGAMOUS-Like 15）基因的研究进展
• 1.5 本项目研究的目的和意义
• 1.6 技术路线
• 2 材料和方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 拟南芥RNA 的提取及cDNA 的合成
• 2.2.2 拟南芥WUS 和AGL15 基因的扩增
• 2.2.3 PCR 扩增产物的TA 克隆
• 2.2.4 植物表达载体pIWUS 和pIAGL15 的构建
• 2.2.5 植物表达载体pIWUS 和pIAGL15 转化农杆菌GV3101
• 2.2.6 pIWUS 和pIAGL15 的遗传转化
• 3 结果与分析
• 3.1 拟南芥RNA 的提取
• 3.2 拟南芥WUS 和AGL15 基因的扩增
• 3.3 拟南芥WUS 和AGL15 基因的TA 克隆及鉴定
• 3.4 植物表达载体pIWUS 和pIAGL15 的构建及鉴定
• 3.5 植物表达载体pIWUS 和pIAGL15 遗传转化
• 4 讨论
• 4.1 植物体细胞胚发生的基因表达调控
• 4.2 植物表达载体的构建
• 4.3 农杆菌转化法
• 4.3.1 农杆菌菌株的选择
• 4.3.2 外植体的选择及预处理
• 4.3.3 农杆菌侵染液浓度
• 4.4 转基因植株的再生
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢