杨树C4H基因RNAi载体和UGPase基因过量表达载体的构建及其遗传转化研究

论文摘要

木质素是维管植物次生细胞壁的主要成分，长期以来由于其降低牧草饲用品质，影响纸张和纤维生物质能源的生产而备受关注。木质素的数量和其反应活性一直是困扰纸浆生产的两个重要的障碍。经过近20年来对苯丙氨酸代谢调控途径的研究，目前木质素合成代谢过程中关键酶的研究比较清晰。肉桂酸4-羟基化酶（C4H）是一类催化香豆酸4’位置的羟基化并且依赖于NADPH的细胞色素P450单氧酶。RNAi技术是一种有效的在转录水平上降低目的基因表达的技术。本研究中，构建C4H基因RNAi载体，通过转基因技术抑制杨树细胞内C4H基因的表达，获得低木质素含量的杨树转基因植株。纤维素微纤丝参与到植物细胞壁的合成，也是制浆过程中所需要的成分。有关纤维素的合成了解的很少，相比较“酶促反应”，科学家更倾向于认为纤维素合成过程是“细胞生理反应过程”。目前有关纤维素合成的研究主要集中在纤维素合成酶（CesA）和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸酶（UGPase）。有研究证明，过量表达UGPase基因可以显著增加植株的生物量和纤维素的含量。本研究中，通过构建UGPase过量表达载体，利用转基因技术提高细胞中UGPase的含量，获得高纤维素含量的杨树转基因植株。分别以南林95杨和南抗杨作为材料，构建了肉桂酸4-羟化酶RNAi载体pBI121+2F和尿苷二磷酸葡糖糖焦磷酸酶过量表达载体pBI121+UGPase。开展了农杆菌介导的遗传转化，并对转基因植株进行PCR检测。获得的主要结果如下：（1）利用RT-PCR技术从南林95杨中克隆到432bp大小的C4H基因片段，并成功构建了C4H基因的RNAi载体。从南抗杨中克隆到杨树全长的UGPase基因序列，全长共1410个碱基，编码469个氨基酸，成功构建UGPase基因的过量表达载体。（2）通过生物信息学分析，UGPase预测的分子量为51.64KD，等电点为5.56。EST表达分析显示该基因主要在花器官或其他顶端生长点组织表达。Pfam软件分析结果显示该酶具有一个明显的UDPGP结构域，运用3D-JIGSAW软件预测该酶的空间结构。UGPase家族进化分析显示，双子叶植物中该家族的保守性较单子叶植物低。（3）运用成功构建的UGPase过量表达载体进行农杆菌介导的杨树遗传转化，最终获得7株抗性苗，PCR初步确认其中有5株是转UGPase基因植株。综上所述，本研究成功从杨树中克隆C4H基因的部分序列和UGPase基因的全长序列，成功构建了C4H基因的RNAi载体。运用多种生物信息学软件，对UGPase基因进行比对、结构预测和进化树分析。成功获得5株过量表达UGPase基因的转基因苗，为进一步研究木质素和纤维素合成代谢奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 文献综述
• 1.1 杨树的简介和其在造纸工业上的应用
• 1.2 木质素简介
• 1.3 木质素生物合成研究进展
• 1.3.1 苯丙氨酸起始代谢途径
• 1.3.2 基因功能的新注释
• 1.3.3 参与还原反应的酶
• 1.3.4 新的代谢途径参与木质素的合成
• 1.3.5 木质素单体的聚合反应
• 1.4 纤维素生物合成研究进展
• 1.4.1 纤维素合酶的研究进展
• 1.4.2 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸酶的研究进展
• 2. 引言
• 2.1 本课题的研究意义
• 2.2 本研究的研究内容和目标
• 2.2.1 研究的内容
• 2.2.2 研究的目标
• 2.3 实验技术路线
• 3. 材料和方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 质粒和菌株
• 3.1.3 引物序列
• 3.2 主要的设备和试剂
• 3.2.1 主要设备
• 3.2.2 主要试剂
• 3.3 实验的方法
• 3.3.1 实验室常用试剂和培养基的配置
• 3.3.2 杨树 DNA 的提取方法
• 3.3.3 杨树 RNA 的提取方法
• 3.3.4 RT-PCR
• 3.3.5 PCR 目的片段的回收和纯化
• 3.3.6 生物信息学分析方法
• 3.3.7 C4H RNAi 表达载体的构建
• 3.3.8 UGPase 过量表达载体的构建
• 3.3.9 农杆菌转化实验
• 3.3.10 农杆菌介导的遗传转化
• 3.3.11 转基因植株的 PCR 检测
• 4. 结果分析
• 4.1 C4H RNAi 载体的构建
• 4.1.1 植物总 RNA 的提取
• 4.1.2 C4H 基因的克隆
• 4.1.3 pUCCRNAi+1F 载体验证
• 4.1.4 pUCCRNAi+2F 载体验证
• 4.1.5 pBI121+2F 载体的验证
• 4.1.6 PCR 验证 pBI121+2F 质粒成功转入农杆菌
• 4.2 UGPase 基因的克隆和生物信息学分析
• 4.2.1 UGPase 基因的克隆
• 4.2.2 蛋白质分子量、等电点及保守结构域分析
• 4.2.3 UGPase 基因功能的挖掘
• 4.2.4 UGPase 蛋白空间结构预测
• 4.2.5 EST 表达模式分析
• 4.2.6 UGPase 家族进化关系分析
• 4.3 UGPase 过量表达载体的构建
• 4.4 PCR 验证 pBI121+UGPase 质粒成功转入农杆菌
• 4.5 抗性愈伤的获得
• 4.6 愈伤组织增殖、诱导分化和生根
• 4.7 抗性植株的检测
• 5. 结论
• 6. 讨论
• 6.1 转基因植株的检测
• 6.2 下一步的工作设想
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简介
• 在读期间发表的学术论文