小G蛋白RhoA在肿瘤细胞核内的分布及其影响因素

论文摘要

到目前为止,国内外对RhoA蛋白功能的研究主要基于其在细胞质和细胞膜的分布上,关于其在细胞核内的定位及其入核机制,尚未见明确报道。此项目在本实验室首先发现RhoA蛋白在人胃癌细胞系SGC-7901的细胞核内有分布的基础上,以多种癌组织和癌旁组织、癌细胞系和转化细胞系为研究对象,在较大范围内系统地研究RhoA蛋白在细胞核内的分布以及这种分布与细胞恶变的关系,并且进一步阐明影响其进入细胞核的因素,探讨RhoA蛋白进入细胞核的机制。研究结果将既有助于全面认识RhoA蛋白在细胞内的功能,又有助于深入研究癌细胞发生发展的机制,为肿瘤的诊断和靶向治疗提供一定的理论依据。目的：（1）观察RhoA蛋白在癌组织及癌旁组织细胞、转化细胞系和癌细胞系细胞核内的分布,阐明RhoA蛋白在多种细胞核内分布的情况,并分析RhoA蛋白在细胞核内的分布与组织细胞恶变的关系。（2）观察癌细胞核内的RhoA是否存在碱基突变,明确RhoA在癌细胞核内的分布是否与其碱基突变有关。（2）观察在一些因素的影响下RhoA在细胞核内的分布,初步阐明其在细胞核内的分布变化可能有关的因素,初步探讨其进入细胞核的机制。方法：第一部分（1）用免疫荧光、免疫组化及Western Blot等方法,观察／检测内源性RhoA蛋白在人胃癌细胞株SGC-7901中的定位。（2）用三种编码不同结构RhoA的质粒DNA（野生型wt、结构活性型63L和无活性型N19）转染人胃癌细胞株SGC-7901,再提取细胞膜、细胞浆和细胞核组分,通过Western Blot方法检测外源性RhoA蛋白在细胞中的定位。（3）用免疫荧光法检测RhoA蛋白在人胃癌细胞株SGC-7901、子宫颈癌细胞株Hela、肺癌细胞株A549、结肠癌细胞株SW480细胞内的分布。（4）用免疫荧光及Western Blot法,观察RhoA蛋白在正常胃粘膜上皮转化细胞株GES和人胃癌细胞株SGC-7901中细胞内的分布差异。（5）用免疫组织化学法,观察RhoA蛋白分别在胃癌、乳腺癌、食道癌、结肠癌的癌组织、癌旁组织、坏死组织细胞中的分布。第二部分用RT-PCR方法扩增RhoA基因,进行测序,分析RhoA的碱基序列,以阐明RhoA蛋白在细胞核内的分布是否与该蛋白发生基因突变有关。第三部分（1）用Western Blot法,观察LPA （RhoA激动剂）、CPT-cAMP （RhoA抑制剂）引起的RhoA蛋白在人胃癌细胞株SGC-7901中的移位,即观察RhoA活性改变对其在细胞内分布的影响。（2）分别抑制RhoA蛋白的异戊二烯基化和甲基化,用免疫荧光方法观察RhoA蛋白的相关修饰对其在细胞内分布的影响。（3）用免疫荧光方法,观察在用地塞米松诱导SGC-7901细胞凋亡过程中,RhoA蛋白在细胞内分布的变化。（4）用H202作用SGC-7901细胞,通过免疫荧光方法,观察细胞损伤情况下RhoA蛋白在细胞内的分布。（5）用通过免疫荧光方法,观察泰素对RhoA蛋白在细胞内分布的影响。（6）用免疫荧光和Western Blot方法,观察LPS诱导SGC-7901细胞发生炎症反应时,RhoA蛋白在细胞内的分布；并观察P38 MAPK抑制剂（SB203580）对其分布的影响。（7）用免疫荧光法,观察出核转运抑制剂（LMB）对RhoA蛋白在细胞内分布的影响。结果：第一部分（1）内源性的RhoA在人胃癌细胞株SGC-7901的细胞膜、细胞浆和细胞核中均有分布。（2）外源性的RhoA在人胃癌细胞株SGC-7901的细胞膜、细胞浆和细胞核中均有分布。（3） RhoA蛋白分布于人胃癌细胞株SGC-7901、子宫颈癌细胞株Hela、肺癌细胞株A549、结肠癌细胞株SW480的细胞膜、细胞质及细胞核,但主要分布在细胞核。（4） RhoA蛋白在正常胃粘膜上皮转化细胞株GES和人胃癌细胞株SGC-7901的胞膜、胞浆和胞核中均有分布,且在SGC-7901细胞核内的含量明显高于GES细胞。（5） RhoA蛋白在胃癌、乳腺癌、食道癌、结肠癌四种组织不同部位的分布情况是：坏死癌组织细胞中的RhoA蛋白含量最高,且主要分布于细胞核中；癌组织中RhoA蛋白含量次之；癌旁组织中RhoA蛋白含量最少。第二部分在人胃癌细胞株SGC-7901中,RhoA基因没有发生碱基突变。第三部分（1）LPA能够引起RhoA从细胞浆向细胞膜和细胞核移位；CPT-cAMP能够引起RhoA从细胞膜和细胞核向细胞浆移位。（2）分别抑制RhoA蛋白的异戊二烯基化和甲基化,对其在细胞内的分布影响不明显,提示RhoA蛋白的修饰对其在细胞核内的分布影响不大。（3）细胞凋亡时,RhoA蛋白在细胞胞核内的分布减少,向细胞膜移位。（4）细胞损伤时,RhoA蛋白的表达量明显增多,且向细胞核内移位。（5）泰素能够使RhoA蛋白从细胞核向细胞浆及细胞膜移位,LPA加剧了这种移位,提示RhoA的移位与细胞内的微管结构有关。（6）以LPS作用细胞模拟炎症反应时,RhoA蛋白从细胞浆向细胞核移位明显,有的细胞甚至出现空浆现象,胞核明显移位向细胞一侧；P38 MAPK抑制剂（SB203580）在早期能够有效阻断LPS导致的RhoA蛋白进入细胞核。（7）出核转运抑制剂（LMB）对RhoA蛋白在细胞核内的分布影响不大。结论：（1） RhoA蛋白在细胞核中的分布是组织细胞共有的普遍现象,且它在细胞核内的分布与组织细胞的恶变有密切关系。（2） RhoA蛋白在癌细胞核内的分布与其碱基突变无相关性。（3） RhoA蛋白在细胞核内的分布受多种因素影响：①RhoA活性增高时,其从细胞浆向细胞膜和细胞核移位,RhoA活性降低时,其从细胞膜和细胞核向细胞浆移位；②细胞发生凋亡时,RhoA在细胞核内的含量减少,从细胞核向细胞膜移位；③细胞发生损伤和炎症时,RhoA含量增多,并从细胞浆向细胞核移位；④抑制微管结构改变的抗癌药物泰素可以阻断RhoA从细胞浆向细胞核移位；⑤蛋白修饰及出核抑制剂对RhoA在细胞核内的分布影响不大,RhoA蛋白进入细胞核的转运方式可能是一个扩散的过程。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 RhoA蛋白的研究背景
• 1.1.1 小G蛋白家族概况
• 1.1.2 RhoA蛋白概况
• 1.1.3 RhoA蛋白的调控
• 1.1.4 RhoA蛋白的生物作用
• 1.1.5 RhoA蛋白与肿瘤
• 1.1.6 RhoA蛋白在亚细胞内的分布
• 1.1.7 结语
• 1.2 本论文研究的目的、意义、方法、实验方案的设计
• 1.2.1 研究目的
• 1.2.2 研究意义
• 1.2.3 研究方法及技术
• 1.2.4 实验方案设计
• 第二章 RhoA蛋白在各种癌细胞中的分布
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.3 统计学分析
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 内源性RhoA蛋白在SGC-7901细胞内的定位
• 2.2.2 外源性RhoA蛋白在SGC-7901细胞内的定位
• 2.2.3 RhoA蛋白在多种癌细胞株细胞核内的分布
• 2.2.4 RhoA蛋白在癌细胞和正常上皮细胞核内的分布差异
• 2.2.5 RhoA蛋白在癌组织细胞中的分布
• 2.3 讨论
• 第三章 癌细胞中RhoA的碱基序列分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 PCR产物鉴定
• 3.2.2 PCR产物测序结果
• 3.3 讨论
• 第四章 影响RhoA蛋白进入细胞核的因素
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 第五章 主要创新点和展望
• 5.1 主要创新点
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的文章