论文摘要
背景:他汀类药物,是目前临床上用于降低血胆固醇的药物,但是在一项回顾性研究中显示,老年妇女服用他汀类药物在降低胆固醇的同时,髋骨密度明显增加,提示他汀类具有改善骨密度的作用。OPG/RANKL系统是近年发现的,在骨质疏松的发病机制及治疗中起着重要作用的一个系统。目的:研究不同浓度的阿托伐他汀钙对体外培养的原代成骨细胞增殖的影响及对OPG,RANKL,M-CSF基因表达的影响,探讨阿托伐他汀钙抗骨质疏松的分子机制,为临床用药提供实验依据。方法:（1）采用胰酶和Ⅰ型胶原酶混合酶消化法分离获得原代成骨细胞;采用“差速贴壁法”进行纯化。光镜下观察细胞的形态结构和生长状况,通过碱性磷酸酶染色和Ⅰ型胶原免疫组化染色SABC法对细胞进行鉴定。（2）取第二代成骨细胞,用不同浓度的阿托伐他汀钙(10-9,10-8,10--7,10-6,10-5mol/L)干预成骨细胞,在24h,48h,72h后分别采用噻唑蓝（MTT）法测定其在490nm处的吸光度值（OD值）,了解阿托伐他汀钙对细胞增殖的影响。（3）用不同浓度的阿托伐他汀钙(10-9,10-8,10-7,10-6,10-5mol/L)干预成骨细胞,在24h,48h,72h后,用实时荧光定量方法检测OPGmRNA,RANKLmRNA,M-CSFmRNA的表达水平。（4）统计学方法:各实验数据采用x±s表示,应用SPSS17.0统计软件进行统计分析,各组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。P﹤0.05,有显著性差异。结果:（1）镜下观察所获得的细胞具有成骨细胞的典型特征,细胞多为单核,呈三角形、多边形、长梭形等形态,并伸有粗大伪足;碱性磷酸酶染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色呈阳性。（2）MTT法结果显示:不同浓度的阿托伐他汀钙(10-9,10-8,10-7,10-6,10-5mol/L)在作用于大鼠原代成骨细胞24小时后,与空白对照组比较,各加药组吸光度值（OD值）没有显著统计学差异（P>0.05）。在作用48小时及72小时后,与空白对照组比较,各加药组OD值均大于对照组,在浓度为10-9,10-8,10-7,10-6mol/L时具有统计学差异（P﹤0.05）。（3）实时荧光定量PCR结果显示:不同浓度的阿托伐他汀钙(10-（9） ,10-8,10-7,10-6,10-5mol/L)可以促进OPG及M-CSF基因mRNA的表达,抑制RANKL基因mRNA的表达,这种作用可能和药物浓度及作用时间有关。结论:（1）采用胰酶和Ⅰ型胶原酶混合酶消化法体外分离成骨细胞,在采用多次“差速贴壁法”可以获得数量多且纯,并且活性很好的成骨细胞。（2）阿托伐他汀钙可以促进成骨细胞的增殖。阿托伐他汀钙可以促进成骨细胞的OPG及M-CSF基因的表达,抑制RANKL基因mRNA的表达。这可能是阿托伐他汀钙抗骨质疏松的重要机制。