慢性肺疾病患儿全血细胞因子研究

论文摘要

背景慢性肺疾病（chronic lung disease, CLD）是早产儿常见的并发症之一,其最终结局为肺组织纤维化,是早产儿致残、致死的重要原因。约10%-15%的患儿于生后1年内死于呼吸衰竭,存活者也需要长期依赖氧气或呼吸机治疗,直接影响患儿日后的生活质量,给家庭和社会带来沉重的经济和精神负担。随着围产医学的不断发展,极低出生体重儿的存活率明显提高,慢性肺疾病的总发病率呈逐年上升趋势,国外报道目前在所有新生儿中慢性肺疾病的发病率为1.5%,已成为新生儿重症监护室（NICU）最棘手的问题之一。CLD的发病机制十分复杂,但其本质是在遗传易感性的基础上,各种医源性因素（如氧中毒、气压伤或容量伤）以及感染和炎症等对发育不成熟的肺造成的损伤,最终导致肺组织异常修复。目前认为炎症反应在慢性肺疾病的发病过程中发挥了极其关键的作用,而细胞因子是参与肺内炎症反应的主要介质,促进着CLD的发生和发展,但确切机制至今仍不明确。已有大量研究评估了CLD或CLD高风险者的羊水、脐带血、血浆、气道分泌物中细胞因子的情况,表明肺组织或支气管肺泡灌洗液（BALF）中的IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等前炎症因子早期呈高水平并持续表达,发生于各种病因造成的CLD中,但持续时间尚有争议。趋化因子包括单核细胞趋化蛋白（MCP）-1,MCP-2,MCP-3,巨噬细胞炎症蛋白（MIP）-1α,MIP-1β均和慢性肺疾病有关。气道分泌物中MCP-1的浓度升高与解脲脲原体气道定植（发生CLD的危险因素之一）有关。支气管肺泡灌洗液中IL-4、IL-10、IL-12、IL-13等抗炎细胞因子未分泌或不规则分泌可能导致肺部炎症反应失控而持续存在,最终纤维组织增生而导致CLD发生。但是也有一些研究并未能证实上述结果：有研究显示支气管肺泡灌洗液及血中IL-6、TFN-α、IL-1β的水平与CLD的发生无相关性；还有实验发现CLD患儿的BALF中,IL-10等下调炎症因子与其他患儿相比无变化。故哪些细胞因子确实参与了CLD的发生,CLD的急性期和非急性期起作用或起关键作用的因子各有哪些,各因子之间关系如何,是否病程前后起作用的因子都一样,或只有急性期有细胞因子参与,患儿的外周血中这些细胞因子是否也发生了类似的变化,具体持续时间等等,仍需进一步探讨。国内外对于CLD细胞因子的研究大都着眼于肺部局部,对于CLD患儿全身免疫状态的研究较少。研究以动物实验居多,临床研究很少,且临床研究的样本量一般较少。患儿全血细胞因子的研究很少。全身免疫是否参与CLD的发病机制,CLD不同阶段患儿全身免疫状态如何,与肺部的局部免疫是否具有相关性,这些问题鲜见相关文献报道。由于样本处理和检测方法的不同,细胞因子的检测结果差别很大,无固定参考数值可用来比较。通过对1个的或个别几个细胞因子的检测并不能反映细胞因子相互作用的复杂网络,解决这个问题的关键是要有统一的样本处理方法,使用灵敏度高,且能同时检测多种因子的的检测仪器。液态悬浮芯片系统是唯一种通过美国FDA认证的芯片检测系统,可以满足快速、微量、同时检测多种细胞因子的需要,降低检测误差。本研究将液态悬浮芯片技术应用于CLD的细胞因子检测,解决早产儿采血量少、检测指标多的矛盾,可同时检测全血中的17个细胞因子。目的通过研究早产儿慢性肺疾病（CLD）全血中17个细胞因子的表达,探讨全身性免疫因素在慢性肺疾病中的可能作用,为寻求CLD的新的治疗方法、指导有针对性的免疫调节治疗在CLD中的应用、改善患儿的预后提供可靠的理论依据。方法1、免疫刺激剂的选择刘占国等（珠江医院免疫移植研究所）的既往研究表明,PHA浓度10ug/ml、刺激全血12小时,为最佳的全血细胞细胞因子分泌刺激剂。因此我们选择PHA作为刺激剂,浓度10ug/ml,刺激时间为12小时。2、研究对象的选择2007年10月至2009年3月,收集南方医科大学附属南方医院、南方医科大学附属珠江医院、广州医学院第三附属医院、广州市儿童医院、广东省人民医院五家三甲医院新生儿利NICU患儿为研究对象。纳入标准：1)、早产儿;2)、胎龄体重无显著性差异：3)、住院满28天；4)、根据28天能否脱离氧气分为两组：慢性肺疾病组（不能脱氧）和对照组（不需要氧）。排除标准：先天性肺发育不良等原因造成的氧依耐予以排除。在28d时采集外周血标本。取得患儿家属的同意后选择患儿未稀释的肝素化全血2ml作为研究样本（同分离的单个核细胞以及稀释的全血样本相比,能更好的模拟全血细胞所处的内环境,更能反映体内的情况）。我们一共收集到27例标本,1例为先天性肺发育不良予以剔除,故供分析标本共26例。其中慢性肺疾病组14例,对照组12例。胎龄为28-33周,体重为700-2500g,两组孕周及体重比较差异无统计学意义（胎龄Z=-1.794,P=0.0729；体重Z=-0.464,P=0.643）。3、细胞因子检测方法的选择在细胞因子检测方面,单一细胞因子的检测并不能反映细胞因子相互作用的复杂网络,故传统的ELISA技术、蛋白质组学技术等均无法满足我们的需求,液态悬浮蛋白芯片技术将流式检测与芯片技术结合在一起,可以一次检测一份样本中多达100种细胞因子的水平,而且检测时间短（大概2小时）,可以满足我们全面快速分析全血中多种细胞因子的要求,因此我们选择通过了美国FDA认证的液态悬浮蛋白芯片技术作为细胞因子的检测技术。4、统计学方法应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,偏态分布的组间比较采用两个独立样本比较的Wilcoxon秩和检验,所测数据以中位数、平均秩次表示,P<0.05为差异有统计学意义；正态分布的数据组间比较采用方差齐的t检验,所测数据以X±S表示；两组间性别分布比较采用Fisher’s Exact Test.以α=0.05为检验标准。结果1、慢性肺疾病组和对照组的一般情况26例标本中CLD组14人,其中男11例,女3例,28-32周的13例,>32周的1例,<1000g的2例,1000g-1500g的7例,1500g-2500g的5例；对照组12例,其中男9例,女3例,28-32周的11例,>32周的1例,<1000g的1例,1000g-1500g的7例,1500g-2500g的4例。两组性别分布差异无统计学意义（P=1.000）,CLD组男性与女性比差异有统计学意义（P=0.000）。两组均有相似的基础治疗：防治感染、改善微循环、补充微量元素、维持电解质和酸碱平衡、静脉营养支持等。不同之处：CLD组到生后28d采血时仍需要氧疗,对照组不需要。2、慢性肺疾病组和对照组的17个细胞因子水平对慢性肺疾病组和对照组的17个细胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、GM-CSF,IFN-γ,TNF-α,G-CSF,MCP-1、MIP-1β分别进行组间比较。两组的GM-CSF、IL-7、IL-4、IL-13、IL-17、G-CSF、IFN-γ、IL-5、IL-12对刺激剂几乎无反应或反应较差。两组的17个细胞因子水平：IL-1β:Z=-1.234,P=0.217;IL-2:Z=-0.522,P=0.602;IL-4:Z=-0.267, P=0.789;IL-5:Z=-0.874,P=0.382;IL-6:Z=-0.206,P=0.837;IL.7:Z=-1.668, P=0.095;IL-8:t=-0.764,P=0.452;IL-10:t=-0.947,P=0.353;IL-12:Z=-0.440, P=0.660;IL-13:Z=-0.749,P=0.454;IL.17:Z=-0.515,P=0.606:GM-CSF: Z=-1.251,P=0.211;G-CSF:Z=-0.945,P=0.344；MCP-1:Z=-0.900,P=0.368: IFN-γ:Z=-0.313,P=0.754;TNF-α:Z=-0.721,P=0.471,以上16个细胞因子P>0.05,两组间比较差异无统计学意义。MIP-1β:Z=-2.623,P=0.009,P<0.05。尽管16个细胞因子无统计学上的差异,但是我们分析数据仍可以发现：CLD组IL-6、IL-13、G-CSF、MCP-1、TNF-α的中位数及IL-8、IL-10的均数比对照组高,IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ、IL-1β、IL-5、IL-12的中位数比对照组低。结论1、CLD患儿MIP-1β较对照组显著降低,我们推测其可能参与了CLD的发病过程,但具体机制尚不明确。2、全身免疫因素在慢性肺疾病的非急性期可能不起关键作用,研究慢性肺疾病非急性期的全身性免疫机制的意义可能需要进一步商榷。3、GM-CSF、IL-7、IL-4、IL-13、IL-17、G-CSF, IFN-γ,IL-5, IL-12可能在全血中未分泌或分泌极少,这可能和早产儿的细胞免疫及体液免疫不成熟,分泌这些因子的能力相对不足有关。4、CLD组IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、G-CSF、MCP-1、TNF-α的浓度有比对照组高的趋势,IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ、IL-1β、IL-5、IL-12的浓度有比对照组低的趋势,但两组差异没有统计学意义,此结果是否与样本数量不足有关,有待进一步研究。由于标本的难取得性,我们样本量偏小,所得结论的准确性可能需要进一步考证。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 中英文对照缩略词表
• 硕士期间发表论文
• 致谢
• 统计合格证明