黄地老虎颗粒体病毒ORF55基因的功能研究

论文摘要

增效蛋白（ENHANCIN）是一种主要由昆虫杆状病毒编码的金属蛋白酶,现已证明它可以促进核型多角体病毒（nucleopolyhedrovirus ,NPV）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）等多种经消化道作用的微生物杀虫剂对害虫的感染,在生物杀虫剂的推广应用和抗虫转基因植物等方面具有很强的应用潜力。本研究利用PCR技术从AsGV基因组中获得enhancin-like全基因及其N-端1020bp截短序列及N-端2679bp截短序列,并对全基因进行序列分析;以PET-32a和PET-28a为表达载体,重组表达质粒转化大肠杆菌（BL21（DE3））,构建全基因及两个截短体的原核表达菌株;纯化分离N-端1020bp的原核表达产物,免疫兔子制备AsGV ENHANCIN的特异性抗体;SDS-PAGE、Western Blot检测目的基因的原核表达,利用亲和层析纯化目的蛋白;初步纯化得到的目的蛋白和不同浓度的HaNPV混合感染3龄初棉铃虫（6日龄）,采用室内生物测定法,鉴定三个基因的原核表达产物对棉铃虫核型多角体病毒（HaNPV）感染性的增效作用。序列分析表明该基因编码产物含有ENHANCIN的保守域,无信号肽序列,不存在a-螺旋跨膜区,另外其拥有特异的C-端脯氨酸富集区,这些特征可能与其作用机制有关;实验获得AsGV ENHANCIN的特异性抗体,并实现AsGV的enhancin-like全基因及两个截短序列（N-端1020bp及N-端2679bp序列）的原核表达;生物测定实验表明,HaNPV浓度为1.17×102PIBS/mL、1.17×103PIBS/mL、1.17×104PIBS/mL时,全蛋白能使幼虫死亡率分别提高16.25%、21.25%和12.5%,增效作用显著,而N-1020截短体则无增效作用,N-2679蛋白有微弱的增效作用。由于N-2679蛋白是舍弃全蛋白C-端脯氨酸富集区得到的蛋白,推测蛋白的C-端脯氨酸富集区在蛋白功能中发挥重要的作用,根据哺乳动物中脯氨酸富集区的功能,推测其发挥的是介导作用,全蛋白作为中介分子增效病毒的感染性。本文的研究为AsGV编码ENHANCIN的推测提供了实验依据,也为生物农药增效剂ENHANCIN的规模化生产和推广应用奠定了研究基础,也有助于丰富对ENHANCIN的增效机制的认识。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 杆状病毒简介
• 1.2 增效蛋白简介
• 1.3 增效蛋白的发现及分布
• 1.3.1 增效蛋白的发现
• 1.3.2 增效蛋白的分布
• 1.4 增效蛋白的特征
• 1.4.1 分子特征
• 1.4.1.1 增效蛋白基因是晚期表达基因
• 1.4.1.2 增效蛋白的定位
• 1.4.1.3 增效蛋白拥有保守的锌结合位点
• 1.4.1.4 增效蛋白富含酸性氨基酸和可能的糖基化位点
• 1.4.1.5 增效蛋白氨基酸水平同源性差异较大
• 1.4.2 生化特征
• 1.4.2.1 金属蛋白酶性质
• 1.4.2.2 其他生化性质
• 1.5 增效蛋白的作用机制
• 1.5.1 介导学说
• 1.5.2 酶解学说
• 1.6 增效蛋白的应用研究
• 1.6.1 GV 与NPV 的复配
• 1.6.2 构建含增效蛋白基因的重组病毒
• 1.6.3 增效蛋白应用于植物转基因
• 1.6.4 增效蛋白工程菌株的构建
• 1.7 增效蛋白的研究展望
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 材料、试剂与仪器
• 3.1.1 菌株与载体
• 3.1.2 酶和其它试剂
• 3.1.3 主要溶液
• 3.1.4 主要仪器
• 3.1.5 实验动物
• 3.1.6 棉铃虫人工饲料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 病毒纯化及AsGV 基因组制备
• 3.2.1.1 病毒纯化
• 3.2.1.2 病毒DNA 的制备
• 3.2.2 引物设计
• 3.2.3 基因的克隆及序列分析
• 3.2.3.1 目的基因扩增
• 3.2.3.2 基因的克隆与测序
• 3.2.3.3 序列分析
• 3.2.4 原核表达载体的构建与鉴定
• 3.2.5 目的蛋白的表达
• 3.2.5.1 蛋白诱导
• 3.2.5.2 蛋白提取
• 3.2.6 目的蛋白的纯化
• 3.2.7 抗体的制备
• 3.2.7.1 抗原准备
• 3.2.7.2 动物免疫及抗体效价检测
• 3.2.7.3 抗体特异性检测
• 3.2.8 目的蛋白的Western blot
• 3.2.9 目的蛋白的功能鉴定
• 3.2.9.1 蛋白处理液的制备
• 3.2.9.2 生物测定
• 4 结果与分析
• 4.1 AsGV 基因组的制备
• 4.2 序列分析
• 4.3 目的基因的扩增
• 4.4 基因表达载体的构建
• 4.4.1 表达载体的构建策略
• 4.4.2 表达载体的验证
• 4.5 N-1020 蛋白的表达及优化
• 4.5.1 N-1020 蛋白的表达
• 4.5.2 表达条件的优化
• 4.6 抗体的制备和检测
• 4.6.1 抗原制备和抗体特异性鉴定
• 4.6.2 抗体的效价检测
• 4.7 全蛋白的表达及Western blot 鉴定
• 4.8 N-2679 蛋白的表达及纯化
• 4.9 生物测定结果分析
• 4.9.1 全蛋白生物测定结果
• 4.9.2 N-1020 蛋白生物测定结果
• 4.9.3 N-2679 蛋白生物测定结果
• 5 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论
• 5.2.1 AsGV ORF55 的编码产物的增效作用
• 5.2.2 AsGV ORF55 编码产物的作用机制
• 参考文献
• 英文摘要