论文题目: 柱状黄杆菌毒力相关因子的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 水生生物学
作者: 谢海侠
导师: 聂品
关键词: 鱼害粘球菌,柱状黄杆菌,毒力因子,胸腺,头肾
文献来源: 中国科学院研究生院（水生生物研究所）
发表年度: 2005
论文摘要: 柱形病是一种全球性的危害极广的细菌性病,其病原为黄杆菌科的柱状黄杆菌(Flabobacterium columnare)。柱形病主要危害鱼类的鳃组织,也可引起体表溃乱。细菌性烂鳃病在我国流行较广且危害严重,是草鱼(Ctenopharyngdon idellus)、鳜(Siniperca chuatsi)等重要养殖鱼类的主要病原。本研究以我国分离的引起柱形病的病原为对象,开展了柱状黄杆菌的毒力因子基因的鉴定方面的研究,并对其中的一些毒力因子的功能开展了研究,为最终研制弱毒苗奠定基础。通过对16S rDNA和16S-23S rDNA基因间隔区序列的研究,对从草鱼鱼种上分离的,当时被定名为鱼害粘球菌(Myxococcus piscicola Lu, Nie & Ko, 1975)的细菌性病原的进化关系进行订正,系统树关系表明鱼害粘球菌与已报道的柱状黄杆菌以100%的支持率和极小的遗传变异(对于16S rDNA,为0.8%,而16S-23S rDNA为0.0%)聚为一支,表明鱼害粘球菌为柱状黄杆菌的同物异名。构建了柱状黄杆菌的三个平行表达文库,制备了抗其外膜蛋白(OMPs)的兔抗。对文库进行影印后进行菌落原位杂交,挑取阳性克隆,测序分析,采用基因组步移的方法进行全长克隆,获得4类基因:滑动相关基因、血清抗性相关基因、膜相关的蛋白酶类及胞外胶原酶及蛋白酶基因。此外,通过简并引物获得了柱状黄杆菌的降解多糖的酶-硫酸软骨素AC裂解酶。对滑动基因gldH与gldJ这两个基因进行原核表达,制备兔抗,然后将柱状黄杆菌通过超速离心进行细胞分相,通过Western-blotting,将GldH及GldJ定位在细菌的外膜相。此外,借助同源双交换,缺失滑动基因gldH内部约300 bp片段并定向插入抗性筛选标记,获得突变子,对突变子的菌落形态的改变、细胞壁荚膜多糖层变化、滑动能力及粘附特性进行了分析,发现突变子菌落边缘假根消失,菌落变得很平滑; 荚膜多糖层变薄; 滑动能力丢失; 粘附能力只有野生型的约1/4。通过设计简并引物,获得了硫酸软骨素AC裂解酶的基因片段,然后通过基因组步移方法,获得了其全长。对其全长进行原核表达,在非变性条件下纯化重组硫酸软骨素AC裂解酶,并将硫酸软骨素A加入到柱状黄杆菌培养基中诱导天
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缩略语表
第一章 柱形病与柱状黄杆菌
1. 柱形病和病原的发现
2. 病原的分离
3. 病原体的形态特征与培养特性
4. 柱状黄杆菌
5. 血清型
6. 宿主范围
7. 病原性
8. 感染及流行
9. 症状及病理
10. 柱形病的诊断
11. 柱形病的预防与治疗
12. 本研究的目的及内容
第二章 鱼害粘球菌是柱状黄杆菌的同物异名
1. 前言
2. 材料与方法
2.1 基因组的提取
2.2 16S rDNA 及16S-235 rDNA 片断的克隆及测序
2.3 分子系统树
3. 结果
4. 讨论
第三章 柱状黄杆菌表达文库的构建及毒力相关基因的筛选
1. 前言
2. 材料、方法与结果
2.1 柱状黄杆菌外膜蛋白的提取
2.2 兔抗血清的制备及ELISA效价检测
2.3 柱状黄杆菌表达文库的构建
2.3.1 菌株、质粒及培养基
2.3.2 基因组的提取及酶切
2.3.3 质粒提取、酶切及去磷酸化
2.3.4 连接、转化及重组率检测
2.4 文库影印及筛选
2.5 部分基因的全长克隆及序列分析
3. 讨论
第四章 滑动相关基因的克隆及功能分析
第一节 滑动相关基因gldH的克隆及功能
1. 前言
2. 材料与方法
2.1 细菌、质粒及生长条件
2.2 相关的分子生物学分析软件
2.3 滑动基因侧翼序列的克隆
2.4 蛋白表达及抗体制备
2.5 细胞分相及Western-blot 分析
2.6 △gldH突变子构建及电转化参数优化
2.7 柱状黄杆菌野生型及突变子的菌落及菌体形态观察
2.8 柱状黄杆菌野生型及突变子体外粘附能力分析
2.9 柱状黄杆菌野生型及突变子几丁质消化能力比较
2.10 柱状黄杆菌野生型及突变子滑动能力比较
3. 结果
3.1 gldH及其侧翼序列分析
3.2 GldH的亚细胞定位
3.3 柱状黄杆菌电转化参数的优化及?gldH 突变子构建
3.4 突变子菌落形态及细胞壁结构的变化
3.5 突变子与野生型粘附能力的比较
3.6 突变子与野生型对几丁质消化能力的比较
3.7 突变子与野生型滑动能力的比较
4. 讨论
第二节 滑动相关基因gldJ的克隆
1. 滑动相关基因gldJ
2. gldJ 的侧翼序列
3. gldJ 的细胞定位
第五章 藻酸盐乙酰转移酶及厌氧诱导的外膜蛋白基因的克隆
1. 前言
2. 材料与方法
2.1 AniA 及 AlgI 基因克隆
2.2 通过Real-Time PCR分析不同氧条件下aniA基因表达
2.2.1 总RNA的提取及纯化
2.2.2 cDNA的合成
2.2.3 aniA在不同氧条件下的瞬时表达分析
3. 结果
3.1 AlgI 结构分析
3.2 AniA 结构分析
3.3 不同氧条件下aniA表达差异比较
4. 讨论
第六章 蛋白酶类基因的克隆
第一节 膜相关的锌金属蛋白酶及脯氨酸寡肽酶基因的克隆
1. 前言
2. 材料与方法
3. 结果
3.1 膜相关的锌金属蛋白酶
3.2 脯氨酸寡肽酶
4. 讨论
第二节 胶原酶及相关蛋白酶基因的克隆
1. 前言
2. 材料与方法
2.1 胶原酶及相关蛋白酶基因的克隆
2.2 重组胶原酶及相关蛋白酶基因的表达及纯化
2.3 胶原酶及相关蛋白酶活性的底物明胶分析
3. 结果
4. 讨论
第三节 嗜热菌蛋白酶基因的克隆
1. 前言
2. 材料与方法
3. 结果与讨论
第七章 硫酸软骨素AC裂解酶基因的克隆及其功能分析
1. 前言
2. 材料与方法
2.1 硫酸软骨素AC裂解酶基因clsA的全长克隆
2.2 clsA 的表达及纯化
2.3 柱状黄杆菌外周质中硫酸软骨素酶的提取
2.4 rChonAC与天然硫酸软骨素AC裂解酶的活性比较
3. 结果
3.1 clsA 的克隆及序列分析
3.2 clsA基因在E.coli 中的表达
3.3 rChonAC 的活性分析
4. 讨论
第八章 鳜胸腺和头肾的发生
第一节 鳜胸腺的发生与细胞学观察
1. 前言
2. 材料与方法
2.1 实验鱼
2.2 光镜观察样品的制备
2.3 透射电镜样品的制备
2.4 扫描电镜样品的制备
3. 结果
3.1 胸腺的发育
3.2 成鱼胸腺的光镜和电镜观察
3.2.1 胸腺上皮细胞
3.2.2 粒细胞及巨噬细胞
3.2.3 囊细胞及其它细胞成分
3.2.4 血-胸腺屏障
3.3 鳜胸腺的小孔观察
4. 讨论
第二节 鳜头肾的组织发生研究
1. 前言
2. 材料与方法
3. 结果
4. 讨论
参考文献
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致谢
发布时间: 2006-04-05
参考文献
- [1].柱状黄杆菌胞外和外膜蛋白及草鱼鳃粘液的蛋白质组学研究[D]. 刘国勇.中国科学院研究生院（水生生物研究所）2006
- [2].柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）菌蜕疫苗的研究[D]. 祝文兴.山东师范大学2012
- [3].鱼类烂鳃病病原柱状黄杆菌基因工程疫苗的研究[D]. 罗璋.华中农业大学2015
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- [8].鳜B淋巴细胞的发生和T淋巴细胞受体基因的克隆[D]. 田敬云.中国科学院研究生院（水生生物研究所）2007