破骨细胞分化过程中microRNA表达谱及miR-148a的功能机制研究

论文摘要

第一部分人外周血单核细胞向破骨细胞分化过程中microRNA表达谱的研究目的：诱导人外周血单核细胞向破骨细胞分化,研究在人外周血单核细胞向破骨细胞分化过程中microRNA表达谱的变化。方法：采用密度梯度离心法从外周血分离单个核细胞贴壁培养,用免疫磁珠法分选出高纯度的CD14+外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）;使用重组人巨噬细胞集落刺激因子（recombinant human-macrophage colony stimulating factor, rh-MCSF）和人核因子κB受体活化素配体（human receptor activator of nuclear factor-κB ligand, hRANKL）诱导CD14+PBMCs向破骨细胞分化,抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP）染色和骨吸收陷窝实验观察破骨细胞的分化成熟情况。建立成熟的诱导人外周血单核细胞向破骨细胞分化的细胞模型。应用miRNA微阵列技术,分析人外周血单核细胞向破骨细胞分化过程中miRNA表达谱的变化。通过qRT-PCR方法验证表达明显变化的miRNA在CD 14+PBMCs向破骨细胞分化过程中的表达情况。选取表达显著增高的miR-148a作为进一步的研究对象。结果：（1）采用密度梯度离心法成功从人外周血中分离出单核细胞,并利用MACS磁珠分选系统分选出高纯度的CD14+PBMCs; （2）rh-MCSF和hRANKL诱导C14+PBMCs培养至14天后,可见TRAP染色阳性的多核巨细胞形成,甲苯胺蓝染色可见骨吸收陷窝形成；（3）用miRNA microarray芯片检测CD14+PBMCs向破骨细胞分化过程中miRNA表达谱变化,发现差异表达的miRNA有27个,表达明显上调的有5个,分别是：hsa-miR-148a, hsa-miR-483, hsa-miR-223, hsa-miR-21, hsa-miR-214;表达明显下调的有4个,分别是：hsa-miR-155, hsa-miR-125a, hsa-miR-27b, hsa-miR-145以hsa-miR-148a表达上调最为明显。（4）对明显差异表达的miRNA进一步行实时定量RT-PCR验证,发现定量PCR结果与芯片结果一致,表明miRNA芯片结果是可靠的。结论：建立了成熟的诱导人CD 14+PBMCs向破骨细胞分化的细胞模型。应用microRNA芯片发现CD 14+PBMCs向破骨细胞分化过程中,hsa-miR-148a, hsa-miR-483, hsa-miR-223, hsa-miR-21, hsa-miR-214表达明显上调,而hsa-miR-155, hsa-miR-125a, hsa-miR-27b, hsa-miR-145表达明显下调。以hsa-miR-148a表达上调最为显著。第二部分miR-148a对破骨细胞分化的功能研究目的：研究hsa-miR-148a在CD14+PBMCs向破骨细胞分化过程中的作用。方法：用rh-MCSF和hRANKL诱导CD14+PBMCs向破骨细胞分化,Northern印迹杂交检测hsa-miR-148a在此过程中的表达模式。根据hsa-miR-148a前体序列设计引物,用pSilencer 4.1-CMV puro合成hsa-miR-148a表达载体pre-miR-148a。将pre-miR-148a转染PBMCs,构建pre-miR-148a过表达细胞模型,转染后加入rh-MCSF和hRANKL诱导分化, Northern杂交检测hsa-miR-148a表达变化,TRAP染色及骨吸收陷窝观察破骨细胞分化情况,实时定量PCR检测破骨细胞分化指标TRAP、NFATc 1 （nuclear factor of activated T cells c1,活化T细胞核因子c1）、OSCAR （osteoclast-associated receptor,破骨细胞相关受体）、CathK （Cathepsin K,组织激酶K） mRNA水平,Western印迹杂交检测TRAP蛋白表达水平。用2’-O-methyl修饰的反义寡核苷酸anti-miR-148a转染PBMCs,构建pre-miR-148a表达降低细胞模型,同样行TRAP染色及骨吸收陷窝实验,实时定量PCR检测TRAP、NFATc1、OSCAR、CathK mRNA水平,Western印迹杂交检测TRAP蛋白表达水平。结果：（1）rh-MCSF和hRANKL诱导CD14+PBMCs向破骨细胞分化过程中,随着诱导时间的延长,hsa-miR-148a表达逐渐增多。（2）用pSilencer 4.1-CMV puro成功构建hsa-miR-148a表达载体pre-miR-148a,能在细胞中高表达hsa-miR-148a。（3） hsa-miR-148a过表达能促进TRAP阳性多核巨细胞形成和骨吸收陷窝形成,提高破骨细胞分化指标TRAP、NFATc1、OSCAR、CathK mRNA水平,提高TRAP蛋白表达水平。（4）抑制hsa-miR-148a能抑制TRAP阳性多核巨细胞形成和骨吸收陷窝形成,降低TRAP、NFATc1、OSCAR、CathK mRNA水平,降低TRAP蛋白表达水平。结论：构建了hsa-miR-148a表达载体,过表达hsa-miR-148a可以促进CD14+PBMCs向破骨细胞分化,而抑制hsa-miR-148a则延缓CD14+PBMCs向破骨细胞分化。第三部分hsa-miR-148a调控破骨细胞分化的机制研究目的：预测并验证hsa-miR-148a作用的靶基因,阐明hsa-miR-148a调控CD14+PBMCs向破骨细胞分化的作用机制。方法：用TargetScan和PicTar等靶基因预测软件分析得到hsa-miR-148a作用的靶基因。将含有hsa-miR-148a结合位点的靶基因MAFB （V-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B, V-maf肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物B）3’UTR片段克隆到pGL3载体的3’UTR区,构建野生型报告载体WT-pGL3-MAFB-3’UTR。同时我们用QuickChange site-directed mutagenesis试剂盒构建了含有突变靶位点的突变型报告载体MUT-pGL3-MAFB-3’UTR。将这两个载体分别与pre-miR-148a或miR-C共同转染PBMCs,检测荧光素酶活性变化以证实该靶基因是否为hsa-miR-148a作用的靶基因。PBMCs单独转染pre-miR-148a, Western杂交和实时定量PCR分别检测靶基因MAFB蛋白和mRNA水平的变化,明确hsa-miR-148a对靶基因的调控作用。PCR扩增MAFB CDS全长片段,连接到pcDNA3.1（+）载体构建野生型靶基因表达载体,同时构建了含有突变靶位点的突变型靶基因表达载体。将这两个载体分别与pre-miR-148a或miR-C共同转染PBMCs,实时定量PCR检测TRAP mRNA水平,靶基因蛋白表达用Western杂交检测。结果：（1）TargetScan和PicTar等靶基因预测软件预测MAFB为hsa-miR-148a作用的靶基因。（2）与转染miR-C对照组相比,pre-miR-148a和WT-pGL3-MAFB-3’UTR共转染组的荧光素酶活性受到明显的抑制,而pre-miR-148a和MUT-pGL3-MAFB-3’UTR共转染组的荧光素酶活性则无明显变化。（3）单独转染pre-miR-148a可以降低MAFB蛋白水平,而对MAFBmRNA水平无影响。（4）pre-miR-148a与WT-pcDNA3.1-MAFB共同转染能增加TRAP mRNA水平,降低MAFB蛋白表达水平；而pre-miR-148a与MUT-pcDNA3.1-MAFB共同转染不能增加TRAP mRNA水平,对MAFB蛋白水平没有影响。因此,我们认为hsa-miR-148a主要通过抑制MAFB蛋白表达来促进破骨细胞分化。结论：（1）构建了野生型和突变型MAFB 3’UTR荧光素酶报告基因载体、野生型和突变型MAFB表达载体。（2）通过靶基因预测软件预测并经荧光素酶报告基因检测证实MAFB为hsa-miR-148a作用的靶基因。（3）hsa-miR-148a在转录后水平抑制MAFB表达,促进破骨细胞分化。（4）MAFB是hsa-miR-148a调控破骨细胞分化过程中最重要的靶基因。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 人外周血单核细胞向破骨细胞分化过程中microRNA表达谱研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 miR-148a对破骨细胞分化的功能研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第三部分 hsa-miR-148a调控破骨细胞分化的机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 总结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
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