前列腺癌相关基因AMACR的转录调控研究

论文摘要

近年来随着人口老龄化及饮食结构的改变,前列腺癌的发病率和死亡率有迅速上升的趋势,探索前列腺癌的综合治疗方法尤其是基因治疗已日益受到重视。AMACR是新近发现的前列腺癌高度相关的基因,本课题对其在前列腺癌细胞中的表达调控机制进行了研究。AMACR是通过cDNA消减文库和高通量微列阵筛选技术,从良、恶性前列腺组织中鉴别的人类前列腺癌及组织特异性基因之一,它在＞70%的前列腺上皮内瘤中度表达、＞95%的初期前列腺癌中高度表达,在正常前列腺中仅有少量表达或无法检出。其表达产物主要参与支链脂肪酸及其衍生物的β氧化代谢和胆汁酸的生物合成,是检测前列腺癌的新型阳性分子标记物,可作为现有前列腺癌诊断方法的重要补充。除了作为一个重要的诊断指标,AMACR与前列腺癌的发生和罹患风险、分化程度均存在一定关系:在体外刺激AMACR过表达有利于前列腺癌细胞的最佳生长;利用RNAi技术沉默AMACR基因则可抑制前列腺癌细胞株的生长,均暗示了AMACR在前列腺癌形成和发展过程中的潜在作用,有可能为前列腺癌的基因治疗提供新的线索。因此阐明AMACR在前列腺癌中过表达的机制对于进一步了解前列腺癌的发生发展机制,探索新的治疗途径有重要意义。来自cDNA芯片和实时PCR的研究结果说明mRNA水平的上调是AMACR在前列腺癌过表达的重要原因。本研究克隆了AMACR 2315 bp（-2252～+63）的启动子序列,插入荧光素酶报道基因表达载体pGL3-Basic,在AMACR表达水平最强的LNCaP细胞中检测了2315bp AMACR启动子的活性。继而利用瞬时转染分析,报道基因分析和电泳迁移率改变分析（EMSA）、综合性突变分析等技术在2315 bp的AMACR启动子中鉴定了一个20-bp功能性正调控序列;利用共转染分析、突变分析、报道基因分析、RT-PCR、Western blot以及EMSA等研究方法发现抑癌基因p53可能通过间接抑制AMACR启动子中的CPBP元件来抑制AMACR的表达。第一部分人AMACR基因启动子的克隆、鉴定及初步分析【研究目的】克隆人AMACR基因5’上游2315 bp启动调控区片段,测定其启动子活性,并对其进行初步分析。【研究方法】①提取人基因组DNA,PCR扩增AMACR基因5’上游2315 bp（-2252～+63）启动调控区序列,插入pGL3-Basic,构建AMACR启动子-荧光素酶报道基因表达载体pGL3-2315,酶切鉴定和测序分析证实插入是否正确。②pGL3-2315瞬时转染前列腺癌细胞LNCaP和PC-3,荧光素酶报道基因分析检测启动子活性。③利用Erase-a-Base System,在pGL3-2315基础上构建5’-缺失突变体库,选取11个较大范围的缺失突变体,瞬时转染LNCaP细胞,报道基因分析观察较大范围的缺失突变对启动子活性的影响。④将各种蛋白因子表达载体与pGL3-2315共转染LNCaP和PC-3细胞,报道基因分析观察各种蛋白因子对启动子活性的影响。⑤pGL3-2315瞬时转染LNCaP细胞,或与pSG5-hAR共转染PC-3细胞后,加入不同浓度的雄激素类似物R1881处理24h,报道基因分析观察R1881对启动子活性的影响。【结果】①重组质粒pGL3-2315酶切鉴定及DNA测序结果均正确。②pGL3-2315在LNCaP细胞呈现很强的启动子活性,在PC-3细胞呈现明显的启动子活性。③pGL3-2315的缺失突变分析显示-423～-93 330 bp区域的缺失可导致启动子活性下降70%。④共转染实验结果显示PPARγ2,PTEN,Sp1,ras和myc的表达载体对2315 bp片段的活性没有明显影响。而p53、C/EBPα、NF-κB p50的表达载体明显抑制AMACR启动子活性。⑤雄激素类似物R1881对pGL3-2315的启动子活性无明显影响。【结论】正确克隆了人前列腺癌相关基因AMACR上游2315 bp（-2252～+63）的启动子片段,该2315 bp片段在LNCaP细胞中呈现了很强的启动子活性。2315 bp片段中存在一个明显的功能性正调控区域（-423～-93）。转录因子p53,C/EBPα和NF-κB p50过表达明显抑制AMACR启动子活性。AMACR启动子活性不受雄激素信号途径调控。第二部分AMACR基因启动子中一个20-bp正调控序列的鉴定【研究目的】在AMACR启动子-423～-93区鉴定具有正调控作用的DNA元件/序列,为进一步研究AMACR基因在前列癌细胞中过表达的转录调控机制奠定基础。【研究方法】①利用Erase-a-Base System建立的缺失突变体库,在pGL3-486（-423）区域内筛选更为精细的缺失突变体,瞬时转染LNCaP细胞,报道基因分析观察启动子活性的变化。②人工合成缺失突变分析发现的20-bp正调控序列,插入异源启动子-荧光素酶报道基因载体pGL3-Promoter中SV40启动子的上游和pGL3-maspin中maspin启动子的上游,瞬时转染LNCaP细胞,报道基因分析观测20-bp正调控序列对异源启动子的作用。③采用PCR连接反应在pGL3-486中删除该20-bp序列,构建内缺失突变体pGL3-486id,瞬时转染LNCaP细胞,报道基因分析观察启动子活性的变化。④采用EMSA检测20-bp正调控序列的特异性结合蛋白。人工合成20-bp正调控序列,以末端转移酶将其末端标记地高辛;提取LNCaP细胞核蛋白,与地高辛标记的20-bp探针进行结合反应,同时进行各种特异性和非特异性竞争结合反应,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,检测电泳迁移率的改变。⑤人工合成20-bp正调控序列作为陷阱DNA。以50～300倍过量的陷阱DNA与pGL3-2315共转染LNCaP细胞,测定双荧光素酶活性,观察20-bp正调控序列陷阱DNA对AMACR启动子活性的影响。【结果】①-136～-117片段的缺失使启动子活性下降了3.8倍,表明该20 bp片段为一正调控序列。②pGL3-486中该20-bp正调控序列的内缺失导致启动子活性下降了67%。③该20-bp正调控序列插入异源启动子SV40和mspin上游,导致SV40和mspin启动子活性分别升高了4.3倍和3.3倍。④利用LNCaP核蛋白提取液检测到了该20-bp序列的电泳阻滞带,可被自身竞争性抑制,但不能被异源序列ARE元件和突变的20-bp序列竞争性抑制。⑤20-bp正调控序列陷阱DNA可明显抑制pGL3-2315的启动子活性,该抑制作用随剂量升高而加强,至200倍过量时达到高峰,可使2315 bp启动子活性降低63%。【结论】在AMACR基因上游启动子-136～-117区鉴定到一个20-bp功能性正调控序列,对AMACR基因在前列腺癌细胞LNCaP中的转录激活有重要作用。在LNCaP核蛋白提取液中检测到与此正调控序列特异结合的蛋白质。进一步的研究将对此结合蛋白进行分离、鉴定,研究其调控机制。第三部分p53对LNCaP细胞中AMACR表达的抑制作用【研究目的】研究p53对LNCaP细胞中AMACR表达的抑制作用,并探讨其作用机制。【研究方法】①以不同剂量的pCMV-p53或pCMV-p53DC瞬时转染LNCaP细胞,利用报道基因分析检测p53过表达对AMACR启动子活性的影响。②以不同剂量的pCMV-p53或pCMV-p53DC瞬时转染LNCaP细胞48h,收集细胞,以RT-PCR、Western blot观察p53过表达在mRNA和蛋白水平对AMACR表达的影响。③pCMV-p53与pGL3-2315及缺失突变体pGL3-486、pGL3-140分别共转染LNCaP细胞,报道基因分析观测启动子活性的变化,大致确定p53在启动子上的间接作用区域。④分析-77至+63（pGL3-140）区内两个潜在的正调控CPBP元件（CPBP1/2）的功能。人工合成CPBP1/2序列,插入异源启动子SV40和maspin上游,瞬时转染LNCaP细胞,报道基因分析观察启动子活性的变化;将50～300倍的CPBP1/2序列作为陷阱DNA与pGL3-2315共转染LNCaP细胞,报道基因分析观察CPBP1/2序列竞争对2315 bp启动子活性的影响。地高辛标记CPBP1序列末端作为探针,提取LNCaP细胞核蛋白,EMSA检测CPBP1序列特异性结合蛋白。⑤确定p53过表达对CPBP1序列的间接性抑制作用。将pCMV、pCMV-p53或pCMV-p53DC分别与CPBP1-SV40启动子-荧光素酶报道基因载体共转染LNCaP细胞,报道基因分析观察SV40启动子活性的变化。分别提取经pCMV、pCMV-p53或pCMV-p53DC转染的LNCaP核蛋白,与地高辛标记的CPBP1探针进行EMSA,观察外源性p53过表达对CPBP1元件结合活性的抑制作用。【结果】①pCMV-p53而非pCMV-p53DC转染可抑制LNCaP细胞中AMACR启动子的活性,该抑制作用呈剂量依赖性。②pCMV-p53而非pCMV-p53DC转染可在mRNA和蛋白水平抑制LNCaP细胞中AMACR的表达,该抑制作用呈剂量依赖性。③p53对AMACR启动子的抑制作用区域在-77～+63（pGL3-140）,MatInspector 2.2在此区域内检索到两个潜在的正调控CPBP元件（CPBP1/2）。④CPBP1序列可使SV40启动子活性升高4.2倍,maspin启动子活性升高2.4倍,而CPBP2序列仅有微弱的增强作用。过量的CPBP1序列陷阱DNA可导致pGL3-2315活性明显下降,而CPBP2元件没有明显作用。CPBP1元件可与LNCaP核蛋白形成明显的阻滞带,该阻滞带可被自身竞争性抑制以及特异性抗体anti-CPBP大部阻断。⑤pCMV-p53而非pCMV-p53DC转染可抑制CPBP1-SV40异源启动子活性。经pCMV-53而非pCMV-p53DC转染的LNCaP核蛋白与CPBP1元件形成的的电泳阻滞带明显减弱。【结论】p53可能通过抑制AMACR启动子中正调控CPBP元件的结合活性,抑制LNCaP细胞中AMACR的表达。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 第一部分 人AMACR基因启动子的克隆及初步分析
• 材料
• 方法
• 人基因组DNA的提取
• AMACR基因5'上游2315 bp启动子片段的PCR扩增及纯化
• 荧光素酶报道基因载体pGL3-2315的构建
• 细胞的培养
• 细胞转染实验
• 荧光素酶活性测定
• pGL3-2315启动子系列缺失突变体的构建
• 结果
• pGL3-2315启动子质粒的鉴定及测序
• pGL3-2315启动子转染LNCaP和PC-3细胞及双荧光素酶活性测定
• pGL3-2315系列缺失突变体的酶切鉴定
• pGL3-2315系列缺失突变体转染LNCaP细胞及双荧光素酶活性测定
• 蛋白因子对LNCaP和PC-3细胞中pGL3-2315启动子活性的影响
• R1881对LNCaP和PC-3细胞中pGL3-2315启动子活性的影响
• 讨论
• 第一部分 总结
• 第二部分 AMACR启动子中一个20-bp正调控序列的鉴定
• 材料
• 方法
• -423片段系列缺失突变体的构建
• 20-bp正调控序列内缺失突变体pGL3-486id的构建
• 20-bp正调控序列-异源启动子-荧光素酶报道基因质粒的构建
• 细胞培养和转染实验
• 双荧光素酶活性测定
• 电泳迁移率变动分析
• 结果
• -423bp片段系列缺失突变体的酶切鉴定
• -423bp片段系列缺失突变体的启动子活性测定
• 20-bp正调控序列内缺失对AMACR启动子活性的影响
• 20-bp正调控序列对异源启动子活性的影响
• EMSA鉴定20-bp正调控序列的特异结合蛋白
• 20-bp正调控序列陷阱DNA对AMACR启动子活性的影响
• 讨论
• 第二部分 总结
• 第三部分 p53过表达对LNCaP细胞中AMACR表达的抑制作用
• 材料
• 方法
• 细胞培养和共转染实验
• 双荧光素酶活性测定
• RT-PCR
• 免疫印迹分析
• CPBP1/2-异源启动子-荧光素酶报道基因质粒的构建
• 电泳迁移率变动分析
• 结果
• 外源性p53过表达对pGL3-2315启动子活性的影响
• 外源性p53过表达对AMACR表达的影响
• p53过表达对pGL3-2315及其缺失突变体启动子活性的影响
• 两个潜在CPBP元件的功能分析
• p53过表达对AMACR启动子中CPBP1序列结合能力的影响
• 讨论
• 第三部分 总结
• 附图
• 参考文献
• 博士在读期间发表的论文目录
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表
• 英文论文