荠菜心皮发育过程中生长素分布研究

论文摘要

荠菜（Capsella bursa-pastoris）十字花科芸苔属一年生草本植物,与同属十字花科的拟南芥（A rabidopsis thaliana）在遗传背景和生理特性方面具有较强的相似性,但二者的心皮和果荚形态则具有十分明显的差异：荠菜果荚为二心15皮发育成的心形结构短角果,而拟南芥为柱形形态的长角果。鉴于生长素在植物器官的建构中具有重要的作用,因此推测生长素在二者的心皮的发育过程中时空上的差异分布,调控细胞分裂不同的方向和频次,最终造成了二者心皮形状的差异。本研究利用生长素特异启动子DR5,与绿色荧光蛋白基因GFP进行分子重组,构建了植物表达载体pBI121-DR5::GFP。作为生长素特异性报告系统DR5::GFP转化野生型荠菜,通过卡那霉素筛选及分子检测,得到了转基因荠菜植株。在转基因荠菜开花期,利用荧光显微镜对其心皮发育过程进行了荧光观察。结果显示荠菜柱头有高强度荧光信号,这说明荠菜柱头存在着高浓度的生长素,维持着心皮中生长素的顶-基端的极性分布：在成熟花药、花粉及珠被内层细胞也表现出极强的荧光信号；这些特性与模式植物拟南芥中的结果一致。但在荠菜早期心皮的两侧上端观察到比中间部分较强的荧光信号,即生长素表现出明显的侧向分和极性,这与拟南芥心皮有着明显的差异。据此我们推测在荠菜心皮的形态建成中,除存在生长素顶-基端的极性分布外,还存在着生长素的两侧极性分布,使细胞维持一定的横向分裂,最终促使心形的短角果形态得以形成。生长素极性分布调控植物对光、重力等向性反应,而生长素输出载体PIN3是参与这一响应过程的关键基因。因此我们采用同源扩增方法,克隆了荠菜PIN3基因cDNA。结果表明该基因编码区全长1950bp,可翻译成649个氨基酸。生物信息学分析表明：荠菜PIN3蛋白基因与拟南芥PIN3基因具有极高的同源性；荠菜P1N3蛋白在等电点、分子量及成熟蛋白大小上与拟南芥PIN3蛋白相差无几,同样也具有保守跨膜结构域,说明了二者在在功能上具有很强的一致性；但在关键位点上也存在着不同之处,说明二者在功能方面也存在着差异性。关于荠菜PIN3表达调控和PIN3蛋白的分布尚有待深入研究。只有进一步揭示荠菜心皮发育中生长素两侧极性分布的分子机理,才能从分子水平揭示短角果形态建成的分子生物学过程。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 生长素、生长素响应基因、启动子及元件
• 1.1 生长素
• 1.2 生长素响应基因
• 1.2.1 Aux/IAA基因家族
• 1.2.2 SAUR基因家族
• 1.2.3 GH3基因家族
• 1.3 生长素响应基因启动子和元件
• 2 生长素的极性运输及对植物发育及器官形态模式的作用
• 2.1 花器官、雌蕊发育及模式建成
• 3 生长素输出载体PIN蛋白家族
• 4 本研究的目的与意义
• 第二章 植物生长素响应特异启动子DR5的设计及报告载体的构建
• 1 材料与试剂
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 酶与试剂盒
• 2 实验方法
• 2.1 生长素特异响应启动子DR5的设计
• 2.2 引物设计
• 2.3 生长素响应特异报告载体pBI121-DR5::GFP的构建及检测
• 2.3.1 pBI121-GFP载体的构建及检测
• 2.3.2 pBI121-DR5::GFP载体的构建及检测
• 3 结果与分析
• 3.1 生长素响应特异启动子DR5的合成结果
• 3.2 生长素响应特异报告载体pB1121-DR5::GFP的构建及检测
• 3.2.1 pBI121-GFP载体的构建
• （1） 绿色荧光蛋白基因GFP扩增结果
• （2） 绿色荧光蛋白基因GFP和pBI121载体的双酶切结果
• （3） 载体pBI121-GFP菌落PCR结果
• （4） 载体pBI121-GFP双酶切检测结果
• 3.2.2 pBI121-DR5::GFP的构建
• （1） 载体pBI121-GFP和pUC19-DR5的双酶切结果
• （2） 载体pBI121-DR5::GFP菌落PCR及酶切检测结果
• 4 讨论
• 第三章 植物生长素报告载体转化荠菜
• 1 材料与试剂
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 培养基
• 1.3 植物材料及植物培养基
• 1.4 酶、试剂与试剂盒
• 2 实验方法
• 2.1 植物表达载体pBI121-DR5::GFP转化根癌农杆菌
• 2.1.1 农杆菌GV3101感受态细胞的制备
• 2.1.2 农杆菌GV3101感受态细胞的转化
• 2.1.3 农杆菌GV3101菌落PCR检测
• 2.2 农杆菌侵染转化野生型荠菜
• 2.3 转基因荠菜荧光显微观察
• 3 结果与分析
• 3.1 pBI121-DR5::GFP转化农杆菌GV3101菌落PCR检测
• 3.2 转基因荠菜鉴定
• 3.2.1 转基因荠菜卡那霉素筛选
• 3.2.2 转基因荠菜分子检测
• 3.2.3 转基因荠菜GFP荧光显微观察结果
• 4 讨论
• 4.1 荠菜遗传转化方法的分析
• 4.2 荠菜遗传转化过程中畸形心皮分析
• 4.3 荠菜种子发芽效率及筛选培养基分析
• 第四章 荠菜生长素输出载体PIN3蛋白基因cDNA的克隆
• 1 材料与试剂
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株与质粒
• 1.3 酶、试剂与试剂盒
• 1.4 试剂
• 2 实验方法
• 2.1 荠菜总RNA的提取及质量检测
• 2.1.1 荠菜花蕾总RNA的抽提
• 2.1.2 RNA质量检测
• 2.2 RT-PCR扩增荠菜PIN3基因
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 荠菜cDNA第一链的合成
• 2.2.3 荠菜PIN3蛋白基因PCR扩增
• 2.2.4 将回收的目的基因片段克隆到pMD18-T Vector上
• 2.2.5 目的基因的检测
• （1） 菌落PCR检测
• （2） 双酶切检测
• 3 实验结果与分析
• 3.1 荠菜花蕾总RNA提取
• 3.2 荠菜PIN3蛋白基因PCR扩增
• 3.3 荠菜PIN3蛋白基因鉴定
• 3.4 荠菜PIN3蛋白基因及蛋白序列分析
• 3.4.1 荠菜PIN3蛋白质等电点及分子量预测
• 3.4.2 荠菜PIN3蛋白质跨膜区的预测分析
• 3.4.3 荠菜PIN3蛋白质信号肽切割位点预测分析
• 3.4.4 荠菜PIN3成熟蛋白二级结构的预测分析
• 3.4.5 荠菜PIN3蛋白与拟南芥PIN蛋白家族比较分析
• 4 讨论
• 第五章 结论与展望
• 1 结论
• 2 展望
• 参考文献
• 附录A: DR5启动子合成报告单
• 附录B: 荠菜PIN3基因测序报
• 附录C: 缩略词表
• 附录D: 主要试剂配置
• 附录E: 载体图谱
• 致谢
• 作者简介