茶树被茶尺蠖取食诱导的HPL基因克隆、功能鉴定与表达特征研究

论文摘要

C6挥发物是植物对害虫进行间接防御的关键物质之一，而植物体内的脂氢过氧化物裂解酶（hydroperoxide lyase，HPL）是其合成的关键酶。而有关茶树HPL基因及其与害虫取食间的关系至今未见报道。论文在本课题组前期建立的茶树被茶尺蠖取食诱导前后的cDNA消减杂交文库（SSH）中获得一条与HPL同源性很高的EST （GenBank：GW342656）基础上，对茶树HPL基因进行了cDNA全长克隆、功能鉴定、及其被茶尺蠖取食诱导的表达特征分析。主要结果如下：（1）利用3’/5’-RACE技术从茶树叶片中克隆了一条编码HPL的cDNA全长，其序列长度为1662bp，从起始密码子开始有5个开放阅读框（ORF），其中最长的ORF编码含491个氨基酸的蛋白质，并命名为CsHPL（GenBank：HM440156），其理论分子量和PI分别为54.88kD和8.02，多序列同源比对分析发现其与番石榴的13-HPL（AF239670）同源性最高，为71%；蛋白质保守功能结构域预测分析表明， CsHPL含有细胞色素P450家族中高度保守的4个结构域A、B、C和D，且结构域A（I螺旋区）中保守的苏氨酸被异亮氨酸所代替，结构域D中高度保守的半胱氨酸残基附近有一些特殊的序列NKQAA；进化树分析表明，CsHPL与番石榴的13-HPL等同在一起属于CYP74B亚类。（2）原核表达分析表明，CsHPL基因表达的蛋白分布于上清和包涵体中，结果产生了分子量约为60kD；体外酶促反应结果显示，原核表达的CsHPL只催化13-HPOT底物，而对9-HPOT不表现活性，因此属于13-HPL类型；原核表达的CsHPL最适温度为25℃，最适pH值为7.0。对CsHPL基因的5个不同ORF（Met1, Met5, Met8, Met9和Met15）全部进行了原核表达，结果发现它们各自表达的蛋白都具有HPL活性。（3）利用GC-MS对原核表达的CsHPL催化产物进行了鉴定，结果表明其将底物13-HPOT催化生成的C6挥发物为（z）-3-己烯醛。（4）Southern blot分析表明，CsHPL基因以单拷贝存在与茶树基因组中。（5）qRT-PCR分析表明，两个茶树品种龙井43和舒茶早被茶尺蠖取食后3-9h， CsHPL基因表达量能够明显上升，且达到最大表达量，随后下降，但是其最大表达量和出现的时间存在品种间差异；龙井43在取食后3h CsHPL基因表达量上升至最大值，为对照的13.6倍，而舒茶早则在9h时表达量最大，为对照的3.9倍。对两个品种进行机械损伤后，CsHPL基因的表达呈现类似的规律。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 不同 HPL 的底物和产物特异性
• 1.2 HPL 的定位与调节
• 1.3 HPL 的结构特征
• 1.4 活性位点
• 1.5 反应机理
• 1.6 HPL 在植物害虫取食防御中的作用机理及其研究现状
• 2 引言
• 2.1 研究意义与目的
• 2.2 研究内容
• 2.3 技术路线
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料与处理
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验处理
• 3.2 仪器与试剂
• 3.2.1 主要实验仪器
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 实验中常用试剂配方
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 总 RNA 的提取和检测
• 3.3.2 CsHPL 基因的 cDNA 的 3’/5’-RACE 反应
• 3.3.3 CsHPL 基因的生物信息学分析
• 3.3.4 CsHPL 基因的原核表达
• 3.3.5 表达的融合蛋白的生物学活性分析
• 3.3.6 产物鉴定
• 3.3.7 CsHPL 基因的 Southern blot 分析
• 3.3.8 qRT-PCR 分析
• 4 结果分析
• 4.1 茶树叶片中总 RNA 的提取与质量检测
• 4.1.1 RNA 琼脂糖凝胶电泳
• 4.1.2 核酸定量仪检测总 RNA 纯度
• 4.2 3’/5’-RACE结果
• 4.2.1 3’/5’-RACE 扩增
• 4.2.2 菌落 PCR
• 4.3 CsHPL 基因 cDNA 全长序列验证
• 4.4 CsHP L 基因序列同源性与进化分析
• 4.5 Southern blot 检测结果
• 4.6 CsHPL 基因的原核表达重组质粒双酶切鉴定
• 4.7 CsHPL 基因的原核表达
• 4.8 CsHPL 基因的原核表达的优化
• 4.9 活性分析
• 4.10 产物鉴定
• 4.11 qRT-PCR 检测结果
• 4.11.1 定量 PCR 反应标准曲线的建立
• 4.11.2 定量 PCR 反应鉴定 CsHPL 基因的诱导表达变化
• 5 讨论
• 5.1 CsHPL 基因的 cDNA 全长克隆和序列分析
• 5.2 CsHPL 原核表达与活性分析
• 5.3 CsHPL 基因 Southern blot 和定量 PCR 分析
• 6 结论
• 参考文献
• 附录 A 中英文缩写与注释
• 附录 B CsHPL 测序结果
• 致谢
• 个人简介
• 成果清单