PNAi相关基因RDE-4表达、蛋白纯化及结晶

论文摘要

根据已报道的RDE-4基因序列,设计一对引物,从含C.elegance的cDNA文库中,通过PCR扩增得到大小为1158nt的RDE-4基因,并把它重组到细菌表达载体pET-21b（+）中,该载体C-端具有6个组氨酸标记多肽。酶切鉴定及序列测定表明,重组表达质粒pET-21b-RDE-4连接区域符合设计要求,具有正确的开放阅读框架,插入片段含有385个氨基酸的完整编码区,其核苷酸序列与报道的RDE-4基因的同源性为100%。重组表达载体导入宿主菌E.coli BL21（DE3）,用终浓度为3mmol/L IPTG诱导,37℃培养6小时后,RDE-4基因的表达量达到最高,每毫升菌液含目的蛋白的量约为2mg。通过大量培养,利用亲和纯化和FPLC纯化技术将RDE-4基因蛋白纯化、浓缩,并用PEG等条件养晶,进行条件筛选。全长基因蛋白晶形不好,进而用胰蛋白酶对RDE-4基因蛋白限制性酶切,通过NI-ATK亲和柱层析,判断目的蛋白的稳定结构域在N-端。根据以上分析结果,重新设计N-端引物,亚克隆RDE-4（1-280Aa,315Aa）基因片段,并将它们插入GEX-6P-1原核载体,该载体N-端带有GST融合标签,构建pGEX-6P-1-RDE-4（1-280Aa,315Aa）表达载体。重组表达载体导入E.coli BL21（DE3）,用IPTG诱导高效表达。通过GST-column亲和层析,纯化RDE-4（1-280Aa）基因片段蛋白,并用PPase在柱上对其进行限制性酶切,一般过夜后洗脱、10KD孔径的超滤管浓缩至1mL,注射器被动注入FPLC上样孔,通过凝胶分子筛进一步纯化,获得高浓度和纯度蛋白,浓度为50mg/mL。用悬吊液滴蒸汽扩散法和40%PEG-600,0.1MCHES,pH6.0[Cryoll screen kit,Enedd Biostructure]加入stock OptionsTM pH screen（Hampton Research）蛋白质养晶条进行养晶,一星期,晶体成规则八面体,通过X-Ray衍射,收到晶体电子密度图及相关数据。本论文研究为进一步研究RNAi的作用机制奠定基础,为研究在此过程中相关蛋白之间的相互作用提供结构依据。

论文目录

• 1 前言
• 1.1 RNA干扰技术及其应用
• 1.1.1 RNA干扰的发现
• 1.1.2 RNA干扰的机制
• 1.1.3 RNA干扰的应用
• 1.1.3.1 研究基因功能的新工具
• 1.1.3.2 疾病的治疗
• 1.2 RDE-4的研究进展
• 1.2.1 RDE-1、RDE-4的发现
• 1.2.2 RDE-1、RDE-4在RNA干扰中的作用
• 1.3 原核表达体系的研究和应用
• 1.3.1 概述
• 1.3.2 pET表达系统
• 1.4 蛋白纯化
• 1.5 蛋白结晶
• 1.6 RDE-4的研究意义、内容及技术路线
• 1.6.1 本研究的技术路线
• 1.6.2 具体的研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 菌种与质粒
• 2.2 方法
• 2.2.1 基因克隆、亚克隆
• 2.2.1.1 RDE-4的引物设计
• 2.2.1.2 PCR扩增反应及其酶切回收
• 2.2.1.3 pET-21b（+）、pGEX-1酶切及大片段回收
• 2.2.1.4 连接反应及转化
• 2.2.1.5 重组子鉴定
• 2.2.2 基因表达和蛋白纯化
• 2.2.2.1 基因表达检测
• 2.2.2.2 可溶性测试
• 2.2.2.3 蛋白纯化
• 2.2.2.4 目的蛋白酶切分析
• 2.2.2.5 PPase柱消化RDE-4（1-280Aa）蛋白
• 2.2.2.6 SDS-PAGE
• 2.2.2.7 考马斯亮蓝染色
• 2.2.3 蛋白质晶体
• 3 结果与分析
• 3.1 重组子的酶切鉴定
• 3.2 重组子的测序鉴定
• 3.3 重组子的表达鉴定
• 3.3.1 SDS-PAGE鉴定
• 3.3.2 可溶性分析
• 3.4 目的蛋白的大量纯化及分析鉴定
• 3.5 蛋白酶切分析
• 3.6 PPase柱上消化RDE-4（1-280Aa）
• 3.7 蛋白质晶体
• 4 结论
• 5 讨论
• 5.1 蛋白纯化的影响因素
• 5.1.1 蛋白质性质
• 5.1.2 分离方法
• 5.2 不溶性蛋白的处理
• 5.3 外源基因表达的影响因素
• 5.3.1 表达载体
• 5.3.2 宿主菌
• 5.3.3 培养条件
• 参考文献
• 附录
• 致谢