斑马鱼ZIP7基因在早期胚胎发育过程中功能初步研究

论文摘要

ZIP7是机体锌离子转运蛋白ZIP家族（SLC39A family）的第7个成员,目前尚未培育出ZIP7基因敲除动物模型,对其体内的功能研究未见报道。为此,本研究使用斑马鱼模型,初步探索了ZIP7基因在早期胚胎发育过程中的功能。首先通过Real-time PCR试验,检测到ZIP7 mRNA在斑马鱼早期胚胎发育过程中持续表达；然后,我们克隆到斑马鱼ZIP7 mRNA的一段序列作为分子探针,使用全胚胎原位杂交的方法揭示了ZIP7 mRNA在斑马鱼早期胚胎发育中的时空表达谱及其表达定位,结果表明,ZIP7 mRNA在胚胎12 hpf广泛表达,但发育到24 hpf以后,其表达主要集中在眼睛周围。本试验通过显微注射ZIP7特异结合的反义吗啡啉寡聚核苷酸（Morpholinos, MO）抑制内源ZIP7 mRNA翻译,可以观察到胚胎出现眼睛发育缺陷、变小、心包膜增大、脊柱弯曲等表型；将克隆到的不带有MO结合位点的ZIP7基因表达质粒,经体外转录为mRNA与MO同时注射到受精卵内,能恢复ZIP7基因沉默的表型,这提示ZIP7蛋白与胚胎早期发育尤其是眼睛发育相关；同样,本试验用一定浓度的锌离子培养液（50μM）培养ZIP7基因沉默的胚胎,也能部分恢复其表型；此外,对ZIP7基因沉默的胚胎进行光源同步辐射X射线荧光试验,可以发现,斑马鱼胚胎眼睛部位锌离子含量明显减少。本试验研究结果表明,斑马鱼ZIP7基因编码的蛋白可能通过调节机体锌离子的摄入从而调控早期胚胎眼睛发育,为进一步研究锌离子转运蛋白ZIP7的功能提供一些理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表（ABBREVIATION）
• 第一部分:文献综述
• 1 斑马鱼作为模式动物在生命科学研究中的优点
• 1.1 斑马鱼成鱼个体小,便于实验室大规模饲养
• 1.2 斑马鱼幼鱼发育快速、性成熟早、繁殖力强
• 1.3 斑马鱼卵体外受精、胚胎透明,易于试验操作和观察
• 1.4 较为完善的胚胎和遗传学实验操作技术
• 1.5 斑马鱼基因组序列的注解完成
• 1.6 斑马鱼品系较丰富
• 2 斑马鱼早期胚胎发育过程及其调控分子机制
• 2.1 受精卵期（0-3/4 hpf）
• 2.2 分裂期（3/4-2（1/4） hpf）
• 2.3 囊胚期（2（1/4）-5（1/4） hpf）
• 2.4 原肠胚期（5（1/4）-10 hpf）
• 2.5 体节期（10-24 hpf）
• 2.6 咽裂期（24-48 hpf）
• 2.7 孵化期（48-72 hpf）
• 3 斑马鱼在生命科学研究中的应用
• 3.1 斑马鱼胚胎发育研究
• 3.2 斑马鱼在遗传与发育过程中基因功能研究
• 3.3 斑马鱼在神经科学中行为学和记忆研究
• 3.4 斑马鱼在药物筛选上的应用
• 3.5 斑马鱼在人类疾病研究中的应用
• 4 哺乳动物锌离子转运蛋白研究进展
• 5 本研究的目的与意义
• 第二部分 ZIP7基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的时空表达
• 1 前言
• 2 Real-time PCR分析ZIP7 mRNA在斑马鱼胚胎中的表达
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试验用鱼
• 2.1.3 斑马鱼总RNA的提取
• 2.1.4 RT-PCR反应
• 2.1.5 Real-time反应
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 Real-time PCR分析ZIP7 mRNA在早期胚胎发育过程中的表达
• 3 整体原位杂交分析ZIP7 mRNA在胚胎早期发育中的表达定位
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 质粒、菌株、酶、试剂（盒）
• 3.1.2 试验用鱼及胚胎处理
• 3.1.3 质粒构建
• 3.1.4 基因克隆
• 3.1.5 整体原位杂交
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 ZIP7探针制备合成
• 3.2.2 ZIP7 mRNA在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达定位
• 3.3 讨论
• 第三部分:ZIP7基因对斑马鱼早期胚胎眼睛发育的影响
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 反义寡核苷酸（Morpholinos,MO）的设计合成及使用
• 2.2 试验用鱼
• 2.3 ZIP7 mRNA表达质粒构建
• 2.4 ZIP7 mRNA体外转录
• 2.5 显微注射
• 2.6 上海光源同步辐射X射线荧光技术
• 3 结果与分析
• 3.1 ZIP7 mRNA表达质粒构建
• 3.2 胚胎ZIP7基因沉默的表型观察
• 3.3 ZIP7 mRNA对胚胎ZIP7基因沉默畸形表型的营救
• 3.4 锌离子对胚胎ZIP7基因沉默畸形表型的营救
• 3.5 BL15U硬X射线扫描ZIP7基因沉默胚胎体内锌离子分布
• 4 讨论
• 4.1 显微注射MO导致基因基因沉默对胚胎发育的影响
• 4.2 不同方法对ZIP7基因沉默表型的营救
• 4.3 光源同步辐射X射线荧光分析技术
• 第四部分 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录