论文摘要
植物油是重要的农产品之一。世界上的植物油几乎都是作为食用油用在食品加工业。然而，从农作物种子中获取的植物油和其衍生物在工业生产方面拥有巨大的潜能，因为它们是很多工业产品的原料。例如，大豆油将近占据了世界植物油市场的60％。棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸是组成大豆油的五大成分。如果农作物中的植物油成分单一，那么它们的商业价值将立刻突显。近几十年来，人们做了大量的工作和努力，期望用遗传的方法提高农作物的油质。通过经典的育种技术，如诱变，筛选，杂交等方法来获得一些应用价值高、性状优良的作物品系。最近几年，随着分子生物学和基因工程的发展，研究者们试图利用基因工程的方法提高现存农作物种子中的有价值的脂肪酸的含量。通过一系列的努力，特别是通过表达序列标签（EST）的使用，很多的合成脂肪酸的关键酶的cDNA已经被鉴定。研究者的工作多是集中在克隆并分析合成重要脂肪酸的途径中所涉及的酶的作用机理，并将这些酶基因转入植物中。这样就加快了我们对油菜的脂肪酸成分改造的步伐。芥酸（erucic acid，C22：1，Δ13）属于超长链脂肪酸（very long chain fatty acid，VLCFAs）。天然的油菜通常富含芥酸（通常为45％—60％）。在植物中脂肪酸合酶复合体催化芥酸的合成。这一合成过程包括四个连续的反应：C18-CoA和丙二酰-CoA聚合生成3-酮酯酰-CoA，3-酮酯酰-CoA的还原，3-羟基酰-CoA的脱水，最后一步是反-2，3-烯酰-CoA的还原。其中的第二步反应是由3-酮酯酰-CoA还原酶（BnKCR2）催化的。对于高芥酸含量的油菜（HEAR）和低芥酸含量的油菜（LEAR）的研究发现，BnKCR2基因在这两种植物种子萌发期间的表达情况不同。BnKCR2基因在低芥酸含量的油菜几乎不表达。在酵母突变株中表达BnKCR2基因，其催化产物明显增加。因此，可以通过表达碳链延长反应中的关键酶基因能够控制植物中芥酸的含量。本实验通过从高芥酸含量的甘蓝型油菜基因组中获得3-酮酯酰-CoA还原酶（BnKCR2）全长的编码序列，构建真核生物表达载体pBI121以及包含反向插入片段的载体，利用农杆菌介导的遗传转化导入油菜，以期获得BnKCR2基因高表达量和通过同源序列的干扰抑制作用从而产生的低表达量的转基因植株。根据Genebank数据库中登记的十字花科植物3-酮酯酰-CoA还原酶（BnKCR2）序列，运用Primer Premier5.0软件设计了引物，并以从甘蓝型油菜叶片中提取的总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，获得了960bp的序列。序列克隆到pMD18-T载体上，并同时挑出两种方向插入片段的重组子。测序结果通过Genbank比对证实该片段与植物中已知的BnKCR2序列有极高的相似性，并且不存在内含子区域，表明该片段也可能通过构建原核表达载体从而在大肠杆菌中得到表达。通过限制性内切酶PstⅠ和XbaⅠ双酶切两种pMD18-T载体重组质粒，将得到的反方向的BnKCR2基因序列定向插入到pBluescript SK质粒中，得到了含有反方向的BnKCR2基因序列的pSK质粒重组子。通过限制性内切酶双酶切上述pMD18和pSK重组质粒，将得到的两种方向的BnKCR2基因序列分别定向插入到pBI121质粒中，则得到分别含有正向插入和反向插入BnKCR2基因的pBI121真核表达载体。将这两种pBI121重组质粒以及负对照含有GUS基因的pBI121质粒转化农杆菌EHA105，并转入油菜中进行表达，研究3-酮酯酰-CoA还原酶（BnKCR2）的功能。根据载体序列和BnKCR2基因序列的序列设计了含有EcoRⅠ酶切位点的引物，利用Pfu高保真酶做PCR扩增得到了5’端含有EcoRⅠ酶切位点而3’端为平端的BnKCR2基因序列，EcoRⅠ酶切消化5’末端并插入到改造自pGEX-2T载体的GTK载体的EcoRⅠ和SmaⅠ多克隆位点之间。构建原核表达载体GTK-BnKCR2。