油菜及小繁缕中与核盘菌毒性因子PG互作蛋白编码基因的筛选及其特征研究

论文摘要

油菜（Brassica napus）是重要的经济作物和主要的油料作物,在国民经济和农业生产中具有重要作用,而由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的油菜菌核病则是我国油菜生产上的重要病害,目前还没有高抗或免疫的抗病品种。研究核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）与油菜等宿主互作的分子机制,寻找一些致病或抗病相关基因,无疑对菌核病的防治有着重要意义。本研究利用酵母双杂交技术（Y2H）,建立了核盘菌诱导的油菜品系RS-1（对核盘菌有部分抗性）及其田间杂草小繁缕（Stellaria apetala Ucria,经接种鉴定对核盘菌免疫）的cDNA文库,以核盘菌毒性因子PG为诱饵蛋白在上述2个文库中筛选到一些互作蛋白,并结合半定量PCR,实时PCR,瞬时表达及亚细胞定位等技术对一些基因进行了初步分析。研究的主要结果如下:一、根据加拿大学者Li等（Li et al.,2004）在NCBI中提交的PG基因序列ORF两端保守区设计引物,通过RT-PCR的方法克隆到了菌核病毒性因子PG基因sspg1d（NCBI编号为AF501307）,并将其克隆到酵母载体pGBKT7上,构建成诱饵载体PG/pGBKT7,为进一步的双杂交筛选奠定了基础;二、分别以油菜和油菜田间杂草小繁缕为材料,构建成了核盘菌诱导的cDNA文库,并且利用构建好的诱饵进行筛选,在油菜中筛选到1个与PG互作的含C2结构域蛋白因子（命名为IPG-1）,C2结构域可与钙离子结合,暗示PG信号转导与钙离子有关。在小繁缕cDNA文库中筛选到1个膜蛋白（命名为XFL-PG-1）及其它6个与抗逆及细胞凋亡等有关的基因,为菌核病的分子防治提供了依据:三、利用半定量RT-PCR,实时PCR技术分析了IPG-1在mRNA水平上的表达差异,发现IPG-1受核盘菌诱导后表达量迅速增加,而且受诱导后在叶片中表达量最多,茎中次之,花中最少;酵母双杂交实验证明IPG-1中与PG互作密切相关的部位位于该基因编码蛋白的C端;瞬时表达研究表明IPG-1编码产物分布于细胞质和膜上,而XFL-PG-1则分布于细胞膜上;四、分别构建了IPG-1的过表达载体、RNA干扰载体,为研究该基因的功能奠定了基础;并且构建了PG和IPG-1的原核表达载体PG-pGEX4T,IPG-1-pET30a,以便进一步研究二者在体外的互作关系;通过RACE和RT-PCR克隆了IPG-1在拟南芥中的同源基因及核盘菌中致病过程中的一个转录因子PAC1基因的片段,构建了它们的干扰载体AIPG-i-pART27,PAC1-i-pART27和PG-i-pART27,用于转基因研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 核盘菌与菌核病
• 1.1.1 核盘菌的分类地位及生物学特性
• 1.1.2 核盘菌所致菌核病的症状及危害
• 1.1.3 核盘菌的致病机理
• 1.1.4 菌核病的防治情况及研究意义
• 1.2 植物抗病防御的病理生理
• 1.2.1 过敏性反应（以下简称HR）
• 1.2.2 系统获得性抗性（system acquired resistance SAR）
• 1.2.3 植物的非宿主抗性——宿主与病原物的互作机制
• 1.2.4 植物抗病反应的信号传导途径
• 1.3 基因全长的克隆方法
• 1.3.1 基因文库的筛选
• 1.3.2 3'RACE or 5'RACE（rapid amplification of cDNA ends）,即cDNA末端快速扩增法
• 1.3.3 计算机杂交（computer hybridization）
• 1.4 酵母双杂交技术
• 1.4.1 基本原理
• 1.4.2 优缺点
• 1.4.3 酵母双杂交系统的进一步发展
• 1.4.4 酵母双杂交系统的广泛应用
• 1.4.5 MATCHMAKER GAL4 TWO-Hybrid System3简介
• 1.5 绿色荧光蛋白标记
• 1.5.1 绿色荧光蛋白研究现状
• 1.5.2 绿色荧光蛋白的应用优点
• 1.5.3 绿色荧光蛋白应用
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 酶与各种生化试剂
• 2.1.4 试验用的引物和寡核苷酸
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 不同RNA的提取及纯化
• 2.2.2 PG基因的克隆及诱饵载体PG-pGBKT7的构建
• 2.2.3 油菜及小繁缕cDNA文库的构建和筛选
• 2.2.4 5'RACE步骤
• 2.2.5 与PG互作基因IPG-1全长的获得
• 2.2.6 RT-PCR及Real Time PCR
• 2.2.7 载体的构建
• 2.2.8 酵母双杂交作用的进一步确认
• 2.2.9 瞬时表达
• 第三章 结果与分析
• 3.1 核盘菌PG基因的克隆及诱饵载体PG-pGBKT7的构建
• 3.1.1 核盘菌PG基因的克隆
• 3.1.2 诱饵载体PG-pGBKT7的构建
• 3.2 油菜cDNA文库的构建及筛选
• 3.2.1 核盘菌接种诱导后油菜总RNA的完整性
• 3.2.2 油菜cDNA文库的构建
• 3.2.3 油菜cDNA文库的质量
• 3.3 IPG-1特征的研究
• 3.3.1 IPG-1的序列分析
• 3.3.2 IPG-1的半定量RT-PCR分析及Real TimePCR分析结果
• 3.3.3 IPG-1的亚细胞定位结果
• 3.3.4 IPG-1与PG酵母双杂交相互作用的进一步验证
• 3.4 小繁缕cDNA文库的构建和筛选
• 3.4.1 小繁缕总RNA的完整性
• 3.4.2 经核盘菌诱导的小繁缕cDNA文库的构建
• 3.4.3 诱饵PG对小繁缕cDNA文库的筛选得到阳性克隆（XEL-PG-1）
• 3.4.4 XFL-PG-1的特征研究
• 3.5 载体的构建
• 3.5.1 PAC-1基因的3'端序列的克隆及其RNAi载体的构建
• 3.5.2 PG基因RNAi载体的构建
• 3.5.3 IPG-1基因及其拟南芥同源基因AIPG的RNAi载体的构建
• 3.5.3 IPG-1基因植物表达载体,原核表达载体的构建
• 第四章 讨论与结论
• 4.1 讨论
• 4.1.1 关于利用核盘菌毒性因子PG作为诱饵利用酵母双杂交筛选互作基因
• 4.1.2 关于目的基因的特征研究
• 4.1.3 关于表达载体的构建
• 4.2 结论
• 参考文献
• 附录:培养基、溶液的配制及载体图谱
• 攻读硕士学位期间已发表和待发表的论文
• 致谢