论文摘要
本实验室前期水稻根基因芯片的研究得到了一个缺铁条件下上调比率最高的基因（OsNAT7）。为进一步研究其转录调控机理,本论文以OsNAT7启动子为研究对象,克隆了该启动子并对其序列进行了生物信息学分析,随后在烟草BY-2悬浮细胞中对OsNAT7启动子的活性进行了分析,为解析该基因的功能提供了参考。生物信息学分析预测到OsNAT7启动子区域含有与铁缺乏响应的顺式作用元件IDE1和IDE2具有同源性的序列。为验证其功能,首先采用巢式PCR获得1.5 kb的启动子片段,并构建OsNAT7p::GUS融合基因。通过基因枪轰击将OsNAT7p::GUS转入到水稻愈伤中,OsNAT7p能够驱动GUS基因顺利表达,表明其具有活性。为进一步确定响应缺铁胁迫的启动子区段,将不同长度OsNAT7启动子5’端缺失片段与报告基因GUS融合构建成系列缺失体,用PEG介导转化烟草BY-2悬浮系原尘质体进行瞬时表达,结果显示含铁和缺铁条件下该启动子活性差异不显著,预测的铁缺乏响应元件不具备功能,表明烟草BY-2细胞中OsNAT7启动子在转录水平不能响应缺铁胁迫。为了获得该启动子的组织器官表达模式,通过农杆菌介导将植物表达载体OsNAT7p::GUS分别转化烟草、水稻和烟草BY-2细胞悬浮系。现已得到转基因的T0代烟草苗、水稻愈伤和烟草BY-2细胞悬浮系。选用转基因的烟草BY-2细胞悬浮系对OsNAT7p::GUS融合基因的诱导表达模式进行了分析,结果显示在转基因烟草BY-2细胞中OsNAT7启动子的活性与铁＼锰＼铜＼锌浓度的变化没有直接的相关性。添加小分子金属螯合剂柠檬酸可以提高OsNAT7p::GUS的表达水平,推测柠檬酸促进了转基因BY-2悬浮系对铁的吸收和转运,是否直接影响OsNAT7启动子的活性尚不清楚。对OsNAT7启动子顺式作用元件进行了全面的预测,并结合之前基因芯片的结果进行分析,发现启动子区域存在与芯片结果中缺铁上调表达基因相对应的顺式作用元件。暗示OsNAT7基因的表达可能受到其它缺铁诱导基因的调控,植物激素和缺铁所致生理状态的变化同样可能对OsNAT7基因的表达产生影响。