犬蝠源呼肠孤病毒的分离鉴定及其生物学特性的研究

论文摘要

将30份广东省韶关市送检的野生犬蝠样品,研磨后接种Vero-E6细胞,从中分离到2株病毒。其中一株在Vero-E6细胞上盲传至第4代开始出现细胞病变,表现为细胞内颗粒增多,细胞收缩、变圆,最后细胞从瓶壁脱落。反复冻融3次后,收集细胞及培养液,电镜观察发现,病毒粒子无囊膜,有双层衣壳,呈正二十面体对称,将病毒命名为Bat/China/2003（B/03）。红细胞凝集试验表明该病毒能凝集健康人O型血红细胞,不能凝集SPF鸡、实验用普通级牛、大鼠和豚鼠的红细胞。理化特性试验表明该病毒对氯仿有抵抗力;能耐受pH3.0的酸性环境;50℃水浴1h病毒丧失感染能力;1M Mgcl2能提高病毒对热的抵抗力,增强病毒的活性。病毒基因组经琼脂糖凝胶电泳分大、中、小3个区段。用哺乳动物呼肠孤病毒（mammalian orthoreovirus,MRV）特异性引物进行反转录-聚合酶链式反应（Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）,扩增得到了预期大小的片段。测序结果经NCBI BLAST分析表明,与呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属的Ndelle virus（NDEV）核苷酸同源性最高为91.2%。用DNAMAN Multiple Alignment进行序列同源性分析,与MRV血清1、2、3型的代表株T1L、T2J、T3D的核苷酸同源性分别为89.9%、76.9%、89.9%。以上结果证明该病毒为呼肠孤病毒科的成员。 采用RT-PCR方法,测定犬蝠源呼肠孤病毒B/03株全基因组10个基因节段完整ORF序列。使用分子生物学软件对其核苷酸和氨基酸序列进行同源性分析,绘制系统发生进化树,并分析各基因编码产物的功能区与结构域,从而预测各蛋白的功能。根据B/03株编码的蛋白和呼肠孤病毒科其它成员编码蛋白的比较结果推测,B/03株的L1、L2、L3、M1、M2、S1、S2、S4基因分别编码病毒的结构蛋白λ3、λ2、λ1、μ2、μ1、σ1、σ2、σ3,而M3、S1、S3基因编码病毒的非结构蛋白μNS、σ1S、σNS（S1基因编码两种蛋白,结构蛋白σ1和非结构蛋白σ1S）。 对功能性结构域的分析表明,λ3蛋白氨基酸序列中含有RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）的保守区,推测是病毒的RdRp。λ2蛋白有鸟苷转移酶和甲基化酶的活性区,推测可能在病毒复制时mRNA的帽化过程中起作用。λ1蛋白的N-末端发现了锌指结构和RNA螺旋酶的保守区,推测λ1蛋白具有dsRNA连接活性和ATPase活性。μ2蛋白含有两个NTP-binding基序,这表明它可能具有核苷三磷酸酶活性。μ1蛋白的C-末端有4个大的亲水区,都位于蛋白的表面,可能形成环和折叠,而且抗原性较高,推测有可能引起宿主细胞的免疫反应。σ1蛋白的N-末端有一个连续的能形成alpha-helical coiled coils结构的七肽重复序列（a-b-c-d-e-f-g）n,该区域可能与病毒的血凝活性有关。同时还发现,σ1蛋白有4个潜在的糖基化位点,推测σ1蛋白可能是糖基化的蛋白,与病毒的吸附有关。σ2蛋白的C-末端有一个双亲性的α-螺旋,它与大肠杆菌的DNA依赖性RNA聚合酶的β亚基非常相似,推测具有dsRNA连接活性。σ3蛋白的N-末端有锌指结构域,C-末端有dsRNA连接区。μNS蛋白的C-末端发现了七肽重复序列能形成alpha-helical coiled coils结构,推测这种结构有利于该蛋白与细胞骨架的连接。在μNS蛋白的N-末端还发现了ATPase的保守区,预示其可能具有ATPase活性。σ1S蛋白富含碱性氨基酸和α-螺旋,有一个潜在的糖基化位点,但其功能尚不清楚。σNS蛋白富含Cys残基和α-螺旋,推测可能具有ssRNA连接活性。

论文目录

• 第一章 绪论
• 1.1 呼肠孤病毒的宿主范围及其引起的疾病
• 1.1.1 呼肠孤病毒的宿主范围
• 1.1.2 呼肠孤病毒引起的人类疾病
• 1.1.3 呼肠孤病毒引起的动物疾病
• 1.2 呼肠孤病毒的形态结构
• 1.3 呼肠孤病毒的生物学特性
• 1.4 呼肠孤病毒的检测方法及分类学依据
• 1.5 呼肠孤病毒的分子生物学特性
• 1.5.1 呼肠孤病毒编码的结构蛋白及其功能
• 1.5.2 呼肠孤病毒编码的非结构蛋白及其功能
• 1.5.3 存在的问题及展望
• 1.6 蝙蝠携带病毒的研究概况
• 1.6.1 国外对蝙蝠携带病毒的研究概况
• 1.6.2 国内对蝙蝠携带病毒的研究概况
• 1.7 本研究的意义
• 第二章 犬蝠源呼肠孤病毒的分离鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 细胞、培养基和血清
• 2.1.2 载体和受体菌
• 2.1.3 实验动物
• 2.1.4 工具酶和主要试剂
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.1.6 引物
• 2.1.7 样品的处理与病毒分离
• 2.1.8 电镜观察
• 2.1.9 红细胞凝集试验
• 2.1.10 氯仿敏感试验
• 2.1.11 耐酸性试验
• 2.1.12 耐热试验
• 2稳定试验'>2.1.13 Mgcl₂稳定试验
• 2.1.14 病毒核酸提取
• 2.1.15 核酸电泳
• 2.1.16 套式RT-PCR
• 2.1.17 PCR产物的回收纯化
• 2.1.18 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.1.19 PCR产物的连接与转化
• 2.1.20 质粒提取与鉴定
• 2.1.21 序列测定及分析
• 2.2 结果
• 2.2.1 病毒的CPE特征
• 2.2.2 电镜观察结果
• 2.2.3 红细胞凝集试验
• 2.2.4 理化特性试验
• 2.2.5 核酸电泳结果
• 2.2.6 RT-PCR结果
• 2.2.7 测序结果与同源性分析
• 2.3 讨论
• 第三章 犬蝠源呼肠孤病毒全基因组序列的测定与分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 L1基因
• 3.2.2 L2基因
• 3.2.3 L3基因
• 3.2.4 M1基因
• 3.2.5 M2基因
• 3.2.6 M3基因
• 3.2.7 S1基因
• 3.2.8 S2基因
• 3.2.9 S3基因
• 3.2.10 S4基因
• 3.2.11 小结
• 3.3 讨论
• 3.3.1 犬蝠源呼肠孤病毒B／03株的同源性分析
• 3.3.2 犬蝠源呼肠孤病毒B／03株编码蛋白的功能分析
• 3.3.3 犬蝠源呼肠孤病毒B／03株的分类学地位
• 3.3.4 呼肠孤病毒的遗传演化分析
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历