多功能淀粉酶OPMA在枯草杆菌中的分泌表达与性质研究

论文摘要

本论文研究了OPMA基因在枯草杆菌表达系统中的分泌表达及表达产物的酶学性质。分别将OPMA-N和OPMA-G基因克隆到表达载体pMA5中,构建了分泌表达载体pMA5-OPMA-N和pMA5-OPMA-G,分别转化枯草杆菌BS168,获得了分泌表达OPMA-N和OPMA-G的工程菌。为了进一步提高分泌酶的活力,分别对工程菌进行了发酵工艺优化。结果表明:BS168/pMA5-OPMA-N的最适发酵条件为:0.5%酵母粉,0.3%尿素,1% MgSO4,pH6.5,培养基的装液量为16%,发酵培养48h;BS168/pMA5-OPMA-G的最适发酵条件为:1%的淀粉,0.8%酵母提取物,1% NaCl, pH7.0,培养基的装液量为32%,发酵培养36h。在上述最适产酶条件下,OPMA-N和OPMA-G分泌水平分别达到发酵液中总蛋白的45%、58%,活力分别达到了4.57U/mg和4.65U/mg。对分泌表达的OPMA-N和OPMA-G进行了酶学性质表征。结果表明,两种酶均只能作用淀粉,产生多种低聚糖,包括麦芽糖,麦芽三糖,异麦芽三塘,异麦芽四糖,但不产生葡萄糖,然而,两者均不催化降解β-环糊精和普鲁兰。为了探索信号肽序列对目标酶分泌量的影响,在获得编码淀粉酶E（amyE）信号肽的DNA序列基础上,成功构建了重组有信号肽的表达载体pMA5-OPMA-SN和pMA5-OPMA-SG,并分别在枯草杆菌BS168中实现了高效分泌表达。与OPMA-N、OPMA-G的分泌水平相比,两者的分泌量均有提高,但不十分显著。比活力分析表明,OPMA-S与OPMA-N相比,有所提高;OPMA-SG与OPMA-G相比,有所降低但均不显著。底物、产物特异性分析表明,OPMA-SN、OPMA-SG与OPMA-N、OPMA-G具有相同的底物和产物特异性。以上结果表明,信号肽的引入只提高了OPMA-N,OPMA-G的分泌水平,但不影响酶的催化特性。

论文目录

• 提要
• 第一章 绪论
• 1.1 α-淀粉酶的研究概况
• 1.1.1 淀粉酶概念和分类
• 1.1.2 α-淀粉酶家族的概念及共性
• 1.1.3 多功能淀粉酶的概念、共性及特性
• 1.1.4 α-淀粉酶的工业应用
• 1.1.5 异麦芽低聚糖
• 1.2 枯草芽孢杆菌表达系统研究进展
• 1.2.1 枯草芽孢杆菌
• 1.2.2 枯草芽孢杆菌的基因工程和表达系统
• 1.2.3 外源蛋白在枯草芽孢杆菌宿主的分泌表达
• 1.2.4 枯草芽孢杆菌分泌机制
• 1.2.5 影响枯草杆菌蛋白质分泌的因素和分泌瓶颈
• 1.3 选题背景与研究内容
• 第二章 多功能淀粉酶OPMA 在枯草杆菌中的分泌表达
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.3 实验方法
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 OPMA-N 在枯草杆菌中的分泌表达
• 2.4.2 OPMA-G 在枯草杆菌中的分泌表达
• 小结
• 第三章 多功能淀粉酶OPMA的酶学性质表征及发酵工艺优化
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.3 实验方法
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 酶学性质表征
• 3.4.2 发酵工艺优化
• 3.4.3 OPMA-N 和 OPMA-G 在最适培养基中的表达
• 小结
• 第四章 信号肽对OPMA 分泌量影响的研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.3 实验方法
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 信号肽序列的分析
• 4.4.2 基因组DNA 和信号肽序列的获得
• 4.4.3 pMA5-SP 分泌表达载体的构建
• 4.4.4 pMA5-OPMA-SN 和pMA5-OPMA-SG 表达载体的构建
• 4.4.5 OPMA-SN 和 OPMA-SG 的分泌表达
• 4.4.6 淀粉酶OPMA-SN、OPMA-SG 的活力测定
• 4.4.7 OPMA-SN、OPMA-SG 催化淀粉降解的产物分析
• 小结
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 中文摘要
• Abstract