DNA shuffling技术改造Bt基因的水稻转化研究

论文摘要

水稻是主要粮食作物之一,全世界有超过20亿的人口以水稻为主食。虫害是造成水稻减产的主要原因之一。在现代农业中,使用化学杀虫剂为减少虫害损失起到了巨大作用。但是,化学杀虫剂的使用会不可避免的造成环境污染以及威胁人类健康。利用转基因技术培育具有抗虫性状的品种是一种控制害虫的有效方法。目前使用最广泛的是Bt基因,其毒蛋白能破坏昆虫的中肠上皮细胞,具有高度专一的抗虫性。然而长期使用Bt杀虫使目标昆虫对Bt毒蛋白产生了耐受性,天然的Bt基因并不总是能达到良好的杀虫效果。为了解决此问题,我们运用DNAShuffling技术把Bt基因进行改组,获得了一批克隆子。体外喂虫实验显示这些重组后的Bt基因较原始基因杀虫性有很大提高。本试验以此为基础,用优良的粳稻品种中花11为受体材料,利用农杆菌介导的遗传转化方法将14个重组后的Bt基因转入水稻,希望能在水稻中表达高效的杀虫蛋白。并且获得了一批外源基因单拷贝插入,抗虫性优良的转基因株系。主要结果如下:1.挑选了Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry9C和Cry2A重组后的14个子基因（722,723,724,738,906,983,385,932,936,185,897,977,901,119）以及对照Cry1Ab、Cry1Ac和Cry2A构建了植物表达载体,并分别转化中花11胚性愈伤;每个片段平均获得抗性植株80棵左右。2.通过对转化植株的PCR阳性检测,获得了约75%的阳性单株。3.通过Southern杂交对转基因植株进行了拷贝数的检测,外源片段以1-12个不等的拷贝数插入水稻基因组。4.通过Northern杂交对T0代植株进行了表达量检测,大多数转基因水稻植株能高量表达Bt蛋白。5.室内人工接种试验的结果显示:部分改组后的Bt基因表达的毒蛋白有较高的杀虫性。6.用ClustW软件分析比对了14个Bt子基因,它们与原始基因的同源性达到了90%以上。并且序列的改变主要发生在结构域1或结构域2处。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 苏云金芽胞杆菌（BT）及其杀虫晶体蛋白
• 1.1.1 苏云金芽胞杆菌（Bt）概述
• 1.1.2 Bt杀虫晶体蛋白及其基因的分类
• 1.1.3 Bt杀虫晶体蛋白的结构与功能
• 1.1.4 Bt杀虫晶体蛋白的作用机制
• 1.1.5 Bt毒蛋白基因的修饰、改造及应用
• 1.2 DNA SHUFFLING技术
• 1.2.1 DNA Shuffling技术的起源
• 1.2.2 DNA改组的创新性
• 1.2.3 DNA Shuffling技术的应用前景
• 1.3 转基因作物的商品化现状
• 1.3.1 转BT植物的安全性及其评价
• 1.3.2 中国转Bt作物的状况
• 1.3.3 昆虫对BT的抗性
• 1.4 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 受体植物材料
• 2.1.2 目的基因
• 2.1.3 农杆菌菌株
• 2.1.4 植物表达载体
• 2.1.5 供试昆虫
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物表达载体的构建
• 2.2.2 农杆菌介导的中花11的遗传转化
• 2.2.3 转基因植株的PCR检测
• 2.2.4 转基因植株的Southern blot检测及拷贝数鉴定
• 2.2.5 转基因植株的Northern blot检测
• 0代转基因植株的喂虫'>2.2.6 T₀代转基因植株的喂虫
• 3 结果与分析
• 3.1 序列比对
• 3.2 超表达载体的鉴定
• 0代转基因植株PCR阳性检测'>3.3 T₀代转基因植株PCR阳性检测
• 0代转基因植株SOUTHERN检测'>3.4 T₀代转基因植株SOUTHERN检测
• 0代转基因植株NORTHERN检测'>3.5 T₀代转基因植株NORTHERN检测
• 4 讨论
• 4.1 DNA SHUFFLING技术
• 4.2 转基因植株农艺性状的改变与克服途径
• 4.3 水稻的组织培养过程
• 4.4 基于HPT基因的PCR阳性检测
• 4.5 分子杂交体会
• 4.6 实验中的不足之处
• 4.7 关于BT基因的运用前景
• 4.8 转基因作物产业化现状
• 参考文献
• 附录
• 致谢