普鲁兰短梗霉HN2-3菌株碱性蛋白酶的纯化、基因克隆、表达、表面展示及生产活性肽的应用研究

论文摘要

从分离自海水、海泥及海洋生物内脏及海生植物表面的400余株酵母菌中分离到5株产蛋白酶的海洋酵母，能在酪蛋白双层平板上形成明显的透明圈，它们分别是HN2-3、N13d、N13C、Mb5和HN3-2。通过酵母鉴定的常规方法并结合分子生物学方法，鉴定出HN2-3、N13d、N13C与HN3-24株菌属于普鲁兰短梗霉（Aureobasidiumpullulans），Mb5菌株属于解脂亚罗酵母（Yarrowia lipolytica）。来自菌株HN2-3所产蛋白酶酶活性及酶解活性肽产物的ACE（AngiotensinI-converting enzyme）抑制活性最高。来自菌株HN2-3的蛋白酶命名为ALP2。利用层析柱Sephadex G-75与阴离子交换柱DEAE Sepharose Fast Flow纯化了菌株HN2-3的胞外碱性蛋白酶ALP2，纯化2．34倍。通过SDS-PAGE凝胶电泳，得到的ALP2蛋白条带分子量为33．0 kDa，最适作用温度为52℃。Mn2+、Mg2+和Na+离子浓度在5 mM时对纯化蛋白酶酶活有激活作用，Zn2+、Ca2+、K+和Li+对酶活的影响不大；而当存在Fe2+、Fe3+、Cu2+、Co2+、Ag+、和Hg2+离子时，蛋白酶活明显降低。苯甲基磺酰氟（PMSF）强烈抑制蛋白ALP2的活性，乙二胺四乙酸（EDTA）与碘乙酸微弱抑制蛋白酶的活性。利用纯化的酶酶解砺虾蛋白，螺旋藻蛋白（Arthospiraplatensis），酵母N3C（Yarrowia，lipolytica）和YA03a（Hansenia sporauvarum）蛋白，来自蛎虾蛋白的水解物ACE抑制活性与抗氧化活性最高，分别达到88．3％与47．3％。这说明纯化的ALP2蛋白酶在食品和医药方面具有良好的前景。利用简并PCR、反向PCR与RT-PCR获得了蛋白酶ALP2基因的DNA序列与cDNA序列。基因ALP2的DNA序列为1354 bp，在NCBI（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／）的登陆号为EU331441。ALP2基因的开放阅读框（ORF）1248 bp，在NCBI上的登陆号为EU224431，编码415个氨基酸，推导分子量为42．9 kDa。基因ALP2具有两个内含子，分别为54bp和52 bp。通过分子生物学软件分析，基因ALP2前18个氨基酸为信号肽序列，此基因编码的蛋白具有丝氨酸活性位点与组氨酸活性位点，等电点为6．44。利用质粒pINA1317对基因进行表达验证，发现转化子能在牛奶-PPB双层平板上形成明显的透明圈。转化子的发酵上清液的蛋白酶活性也进行了检测，结果说明克隆到的基因ALP2确实为蛋白酶基因，而且能在Y.lipolytica中进行表达，并分泌到细胞外。利用本实验室构建的表面展示质粒pINA1317-YICPW110对蛋白酶基因ALP2进行了表面展示，转化子能在牛奶双层平板上形成明显的透明圈。表面展示的蛋白酶酶解不同的蛋白源能够产生活性肽，发现酶解金黄色隐球酵母G7a（Cryptococcus aureus）的细胞蛋白所产活性肽的ACE抑制活性最高，酶解螺旋藻蛋白所产活性肽的抗氧化活性最高。这是首次关于利用表面展示蛋白酶进行活性肽的生产的报道。将表面展示的蛋白酶进行了酶学特性研究，发现与菌株HN2-3所产的野生型蛋白酶相比，最适作用温度有所降低，温度稳定性增强；另外发现表面展示的蛋白酶对金属离子的亲和力降低。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 前言
• 第一节 蛋白酶的研究进展
• 第二节 生物活性肽的研究进展
• 第三节 表面展示技术的研究进展
• 第四节 海洋酵母的研究进展及本研究的目的与意义
• 第二章 产蛋白酶海洋酵母的筛选
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 产蛋白酶海洋酵母的筛选
• 3.2 5株海洋酵母的鉴定
• 3.3 酶解蛎虾蛋白所产活性肽的ACE抑制活力测定
• 4 本章小结
• 第三章 A.pullulans HN2-3蛋白酶的分离纯化、特性研究及酶解不同蛋白源产活性肽的研究
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果与讨论
• TM G-75凝胶层析部分纯化'>3.1 蛋白酶发酵液浓缩及Sephadex^TMG-75凝胶层析部分纯化
• 3.2 DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱纯化化
• 3.3 不连续SDS-PAGE凝胶电泳
• 3.4 纯化蛋白酶最适作用温度与温度稳定性
• 3.5 纯化蛋白酶最适作用pH与pH稳定性
• 3.6 金属离子对蛋白酶ALP2酶活的影响
• 3.7 蛋白抑制剂对纯化蛋白酶ALP2酶活的影响
• 3.8 蛋白水解产物ACE抑制活性和抗氧化活性
• 4 本章小结
• 第四章 A.pullulans HN2-3蛋白酶基因克隆与信息学分析
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果和讨论
• 3.1 简并PCR引物的设计
• 3.2 简并PCR克隆碱性蛋白酶ALP2部分基因
• 3.2.1 A.pullulans HN2-3基因组DNA的提取及简并PCR
• 3.2.2 简并PCR结果
• 3.3 反向PCR获得碱性蛋白酶ALP2全部基因
• 3.3.1 反向PCR引物设计
• 3.3.2 限制性内切酶酶切基因组DNA及连接环化
• 3.3.3 反向PCR
• 3.4 碱性蛋白酶基因ALP2生物信息学分析
• 3.4.1 序列在NCBI的比对结果及碱性蛋白酶基因ORF框推测
• 3.4.2 反转录PCR
• 3.4.3 碱性蛋白酶ALP2氨基酸序列分析
• 4 本章小结
• 第五章 普鲁兰短梗霉HN2-3蛋白酶基因APL2的表达
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 受体菌的选择
• 3.2 PMD19-T simple-ALP2重组质粒构建
• 3.3 连接表达载体的阳性克隆的检测
• 3.4 含蛋白酶基因的质粒片断转化Y.lipolytica Polh
• 3.5 转化子蛋白酶活力的测定
• 4 本章小结
• 第六章 A.pullulans HN2-3蛋白酶ALP2的表面展示及表面展示蛋白酶的特性研究
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 蛋白酶ALP2表面展示质粒构建
• 3.2 PMD19-T Vector simple-ALP2重组质粒的构建
• 3.3 重组质粒pINA1317-YICPW110-ALP2的构建
• 3.4 含蛋白酶基因的质粒片断转化Y.lipolytica Polh
• 3.5 免疫荧光反应
• 3.6 转化子蛋白酶活力的测定
• 3.7 具6×His标签的表面展示蛋白的特性研究
• 3.7.1 表面展示蛋白酶最适作用pH与pH稳定性
• 3.7.2 表面展示蛋白酶最适作用温度和温度稳定性
• 3.7.3 金属离子对表面展示蛋白酶ALP2酶活的影响
• 3.7.4 蛋白抑制剂对表面展示蛋白酶ALP2酶活的影响
• 4 本章小结
• 第七章 表面展示蛋白酶ALP2酶解不同蛋白源产活性肽的研究初步
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 蛋白水解产物抑制ACE活性与抗氧化活性
• 3.2 表面展示蛋白酶使用周期的测定
• 4 本章小结
• 参考文献
• 总结与创新点
• 发表的学术论文
• 附录
• 致谢