半夏高温倒苗过程中总RNA及基因差异表达片段的研究

论文摘要

半夏Pinellia ternata（Thunb.）Briet.为天南星科半夏属多年生宿根草本植物,以块茎入药,是一种重要的中药材。在气温高于26℃,半夏地上部分随即枯萎,俗称“倒苗”。在实际生产中高温引起的半夏倒苗会直接导致其产量的降低。而半夏高温倒苗的机理还不清楚。为了给研究半夏高温倒苗的机理提供基础,本研究建立了一种经济、简单、高效的半夏高质量总RNA提取技术,通过DDRT-PCR技术及基因序列分析软件,对高温胁迫倒苗过程中的半夏总RNA含量变化与基因差异表达片段进行了深入的研究。结果如下:1.对异硫氰酸胍法、皂土法、CTAB-LiCl法和SDS/酚法四种改进的RNA抽提方法提取结果进行分析比较。结果表明,皂土法的提取过程只需3～4小时,是其它3种提取方法所用时间的一半。提取1克叶片的成本只有其它3种方法的1/13～1/14。此法提取的总RNA 18S、28S带型清晰无弥散,完整性好,无蛋白质和其它杂质污染,OD260/OD280介于1.8～2.0之间,OD260/OD230大于2.0,且总RNA的产率高,为365.744μg/g鲜重,提取的总RNA适用于RT-PCR试验,可以用于后续的分子生物学研究,是一种快速、经济,适于抽提半夏总RNA的好方法。2.以经过高温胁迫处理不同时间的半夏叶片为材料,通过测定总RNA含量变化和基因差异表达显示技术,分析了半夏高温倒苗过程中总RNA及基因差异表达的变化。结果显示,总RNA的含量变化分为三个降低阶段和两个升高阶段,胁迫0 h和6 h时含量最高,胁迫4 h、42 h和倒苗时含量最低,差异显示表明胁迫6 h的样品条带多态性和带型与0 h的接近,其余胁迫时间的样品条带远少于0 h和6 h时的样品的条带,并且在不同的样品之间均有差异条带出现。这说明在半夏经高温胁迫而倒苗的过程中,其基因表达开启与关闭和基因表达增强与减弱模式具有一定的规律,并且可能启动了不同的基因表达系统,从而为研究半夏高温倒苗的分子机理提供了信息。3.利用DDRT-PCR共分离出33个差异片断,选择其中的18个片断,通过对序列同源性分析及阳性鉴定,共得到7个阳性片断,其中3个（片断5、11、17）搜索到同源序列,4个（片段4、7、12、13）未搜寻到同源序列。因为目前国内外对半夏相关基因的研究还是很少,未搜寻到同源序列的原因可能有两种:一种是这些获得的特异片段只是一些基因的3’末端,而基因的5’和3’末端非翻译区同源性很小;另一种就是这些片段代表了一些特异的新基因,还有待于进一步的研究。而搜索到同源序列的两个片断分别是对核酸合成有作用的核酮糖磷酸差向异构酶（ribulose-5-phosphate-3-epimerase）mRNA和高温胁迫过程中对保护光合器官起到重要作用的紫黄素脱环氧化酶的mRNA。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 文献综述
• 1.1.1 半夏倒苗的研究进展
• 1.1.2 植物适应高温逆境的分子机理
• 1.1.2.1 耐热性的获得
• 1.1.2.2 热激蛋白与植物耐热
• 1.1.2.3 热激蛋白与植物耐热
• 1.1.2.4 HSP基因的表达调控
• 1.1.2.5 植物在高温胁迫时的信号转导因子及基因表达调节
• 1.1.3 研究植物基因差异表达的方法
• 1.2 研究目的、内容及意义
• 2 材料和方法
• 2.1 植物材料
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要仪器
• 2.4 半夏总RNA提取方法的建立
• 2.4.1 植物材料处理
• 2.4.2 总RNA抽提
• 2.4.2.1 异硫氰酸胍法
• 2.4.2.2 皂土法
• 2.4.2.3 CTAB-LiCl法
• 2.4.2.4 改进的SDS/酚法
• 2.4.3 总RNA检测
• 2.4.3.1 总RNA的纯度及完整性检测
• 2.4.3.2 RT-PCR检测
• 2.4.3.3 最有效的总RNA提取方法提取半夏不同组织总RNA的效果
• 2.5 半夏高温倒苗过程中总RNA及基因差异表达片段的研究
• 2.5.1 植物材料处理
• 2.5.2 所用引物
• 2.5.3 RNA抽提
• 2.5.4 总RNA质量检测和浓度测定
• 2.5.5 总RNA含量变化分析
• 2.5.6 DDRT-PCR与差异条带的获得
• 2.5.7 差异条带的二次扩增与回收
• 2.5.8 差异条带的二次扩增产物的AT克隆
• 2.5.8.1 制备大肠杆菌感受态细胞
• 2.5.8.2 连接反应（操作过程）
• 2.5.8.3 连接产物的转化与涂板
• 2.5.8.4 阳性重组子的筛选与鉴定
• 2.5.8.5 差异表达片段序列和同源性分析及半定量RT-PCR验证
• 3 结果与分析
• 3.1 提取半夏总RNA的新方法
• 3.1.1 不同方法提取总RNA的完整性、纯度与产率
• 3.1.2 不同提取方法所用时间及成本比较
• 3.1.3 皂土法提取的总RNA对分子生物学试验的适用性
• 3.1.3.1 总RNA中的DNA去除及纯化
• 3.1.3.2 逆转录反应
• 3.1.3.3 PCR反应
• 3.1.4 皂土法对半夏不同组织器官的适用性
• 3.2 半夏高温倒苗过程中总RNA及基因差异表达片段
• 3.2.1 总RNA质量
• 3.2.2 高温胁迫过程中总RNA含量的变化趋势
• 3.2.3 DDRT-PCR结果及差异条带的获得
• 3.2.4 差异条带二次扩增与回收结果
• 3.2.5 重组子酶切鉴定结果
• 3.2.6 差异表达片段序列和同源性分析及半定量RT-PCR验证
• 4 讨论
• 4.1 常规方法提取半夏总RNA的缺点与新方法的建立
• 4.2 半夏高温倒苗过程中总RNA的变化
• 4.3 MRNA差异显示得到的相关基因片断
• 5 小结
• 参考文献
• 图版
• 致谢
• 下一步工作设想
• 作者简历
• 研究生在读期间发表文章