抗生素HYGROCINS生物合成基因簇的克隆

论文摘要

抗生素hygrocins是从吸水链霉菌ATCC 25293中分离到的一种与雷帕霉素共结晶的浅黄色物质。根据结构可分为hygrocin A和hygrocin B。化学结构分析表明,hygrocins是一种新的安莎类抗生素,具有抗细菌活性。为了研究hygrocins的生物合成过程,本文构建了吸水链霉菌ATCC 25293的基因组文库,以安莎类抗生素前体3-氨基-5-羟基苯甲酸（AHBA）合成过程中的关键酶-AHBA合成酶的氨基酸保守序列,设计引物来筛选文库。筛选得到的7个阳性cosmid克隆经过重叠图谱分析、亚克隆测序后,选择了同时含有AHBA酶系和聚酮合酶（PKS）基因的cosmid 13F11进行shotgun测序。在获得13F11的全部序列信息基础上,通过染色体步移获得了更多含有hygrocin生物合成基因的DNA片段。目前已完成2个cosmid的测序工作,得到55.444 kb的序列。生物信息学分析,发现该区域含有前体AHBA合成所必须的五个AHBA酶系基因、五个聚酮合酶基因、三个氧化酶基因及其它可能与合成后修饰、转录调节及运输等相关的基因。为验证所获得的生物合成基因簇的功能,分别构建了AHBA合成酶基因hgnI和聚酮合酶基因hgnE的中断质粒,经过接合转移导入吸水链霉菌ATCC 25293中,通过同源重组中断了这两个基因。HPLC分析表明AHBA合成酶基因和PKS基因的中断菌株都丧失了合成hygrocins的能力,从而证实所克隆的hygrocins生物合成基因簇的正确性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一章 文献综述
• 1.1 链霉菌的特点
• 1.2 链霉菌的次级代谢
• 1.3 安莎类抗生素的生物合成
• 1.3.1 Ⅰ型PKS
• 1.3.2 AHBA的合成
• 1.4 利福霉素B的生物合成过程
• 1.5 格尔德菌素的生物合成过程
• 1.6 吸水链霉菌ATCC 29253研究现状
• 1.7 研究的目的和意义
• 第二章 材料和方法
• 2.1 菌株和质粒
• 2.2 生化试剂
• 2.3 培养基
• 2.4 实验方法
• 第三章 吸水链霉菌ATCC 29253基因组文库的构建
• 3.1 前言
• 3.2 结果和分析
• 3.2.1 基因组DNA的处理
• 3.2.2 文库构建用的载体
• 3.2.3 文库质量检测
• 3.3 讨论
• 第四章 基因文库的筛选及分析
• 4.1 前言
• 4.2 结果和分析
• 4.2.1 简并性引物的设计
• 4.2.2 文库筛选
• 4.2.3 Cosmid阳性克隆的分析
• 4.3 讨论
• 第五章 鸟枪法测序及染色体步移
• 5.1 前言
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 Cosmid DNA的处理
• 5.2.2 文库的筛选
• 5.2.3 序列的拼接
• 5.2.4 染色体步移
• 5.4 讨论
• 第六章 hygrocins生物合成基因簇分析
• 6.1 前言
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 对已知序列的ORF分析
• 6.2.2 Hyrocins生物合成基因簇的验证
• 6.2.3 后修饰基因的功能分析
• 6.3 讨论
• 第七章 总结和展望
• 7.1 总结
• 7.2 展望
• 参考文献
• 致谢