适冷蛋白酶与中温蛋白酶温度适应的分子基础及其在海洋生物蛋白资源高值化加工中的应用研究

论文题目: 适冷蛋白酶与中温蛋白酶温度适应的分子基础及其在海洋生物蛋白资源高值化加工中的应用研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 海洋生物学

作者: 何海伦

导师: 张玉忠

关键词: 适冷蛋白酶,中温蛋白酶,适冷的分子基础,中国毛虾,蛋白酶解,抑制肽

文献来源: 山东大学

发表年度: 2005

论文摘要: 第一部分、适冷蛋白酶和中温蛋白酶温度适应的分子基础 自1999年以来,实验室开展了对深海适冷微生物和适冷蛋白酶的研究工作。陈秀兰等（2001）从1855米深的海底淤泥中分离到产适冷蛋白酶的适冷菌Pseudoalteromonas sp.SM9913,分离纯化了该菌分泌的具有典型适冷特征的适冷蛋白酶MCP—01,对并对其酶学特性进行了系统的研究,研究表明MCP-01为适冷丝氨酸蛋白酶（Chen et al,2002,Chen et al,2003a;Chen et al,2003b）。在此研究基础上,以属于同一家族的中温蛋白酶BP-01为参照,对MCP—01结构与功能的关系进行了系统的研究,揭示了MCP-01高效适冷催化、稳定性差、对热敏感的分子结构基础。 首先克隆了BP—01的基因,根据基因的碱基序列推导出BP-01的氨基酸序列,与潘军（2005）推导的MCP-01的氨基酸序列进行比对,结果表明MCP-01和BP-01的氨基酸序列同源性较低。通过同源模建,分别构建了MCP-01和BP-01的三维结构。MCP-01和BP-01的催化结构域都属于subtilase-S8类型,二者的活性中心的构象相似,由α螺旋和β折叠组成了酶的催化腔,参与催化反应的三个氨基酸残基Asp,Ser和His都位于催化腔内,表明MCP-01和BP-01的催化机制相同。与BP-01相比,MCP-01分子中α螺旋较少,而β转角和无轨卷曲较多,使得分子柔性增强,更易变构,CD光谱检测也证实了这一点。MCP-01和BP-01的变构温度分别为49.5℃和60.2℃,表明MCP-01更易变构。 丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF能够完全抑制MCP-01和BP-01的活性,但CD光谱和荧光光谱表明,PMSF对两者的构象没有影响。由于MCP-01活性中心有Ca2+存在,EDTA对MCP-01构象和活性影响较大,α螺旋减少明显减少,而对BP-01的活性和构象没有影响,推测MCP-01的柔性构象需要Ca2+维持其稳定。 盐酸胍通过争夺蛋白质分子中结合的水分子而引起蛋白构象的改变。盐酸胍使两种蛋白酶的荧光发射峰降低,且发生红移,MCP-01红移较大,近20nm,说明MCP-01和BP-01分子中Tyr和Trp的位置及其之间的相互作用存在差别。CD光谱表明,盐酸胍使BP—01和MCP—01二级结构丧失一半的浓度分别1.8M

论文目录:

摘要

英文摘要

研究背景和立题依据

1.研究背景

1.1 蛋白酶结构和功能的研究进展

1.1.1 蛋白酶的分类

1.1.1.1 外肽酶

1.1.1.2 内肽酶

1.1.2 蛋白酶的催化机理和结构特征

1.1.2.1 蛋白酶的催化机理

1.1.2.2 适冷蛋白酶的结构特征

1.1.3 蛋白酶结构与功能的研究方法

1.1.3.1 圆二色光谱分析蛋白质构象

1.1.3.2 荧光光谱法分析蛋白质的构象

1.1.4 蛋白酶的用途

1.1.4.1 洗涤剂用蛋白酶

1.1.4.2 蛋白酶在皮革工业中的应用

1.1.4.3 食品工业

1.1.4.4 医药工业

1.2 海洋蛋白资源酶解利用的研究进展

1.2.1 海洋低值蛋白资源的酶解利用

1.2.1.1 酶解海洋蛋白资源所用的工具酶

1.2.1.2 酶解的海洋蛋白资源的种类

1.2.1.3 海洋蛋白酶解的一般特性

1.2.1.4 海洋蛋白资源酶解产物的开发利用

1.2.1.5 今后酶解海洋蛋白的研究方向

1.2.2 海洋优质水产品的保鲜增鲜研究进展

2.立题依据

2.1 适冷蛋白酶结构和功能研究存在的不足之处

2.2 海洋蛋白资源酶解利用研究的不足之处

2.3 研究内容和意义

2.3.1 MCP—01和BP—01结构和功能的比较

2.3.2 海洋低值蛋白资源的酶解利用研究

2.3.3 海洋高附加值蛋白资源的保鲜增鲜

第一部分

第一章 MCP-01和BP-01的分离纯化和性质研究

1.1 材料与方法

1.1.1 实验材料

1.1.2 实验方法

1.2 结果与分析

1.2.1 适冷蛋白酶MCP-01的纯化及性质

1.2.1.1 适冷蛋白酶MCP-01的纯化

1.2.1.2 适冷蛋白酶MCP-01的性质测定

1.2.2 菌株Bacillus sp.SM98011的菌种鉴定

1.2.2.1 菌体形态特征

1.2.2.2 培养特征

1.2.2.3 生理生化特征

1.2.2.4 菌株Bacillus sp.SM98011的16SrDNA序列扩增测序

1.2.3 Bacillus subtilis SM98011发酵条件的确定

1.2.3.1 不同氮源对产酶的影响

1.2.3.2 不同碳源对产酶的影响

1.2.3.3 发酵时间对产酶的影响

1.2.3.4 摇瓶装量对产酶的影响

1.2.3.5 培养基起始pH值对产酶的影响

1.2.3.6 培养温度对产酶的影响

1.2.4 Bacillus subtilis SM98011所产蛋白酶的纯化及酶学性质研究

1.2.4.1 Bacillus subtilis SM98011所产蛋白酶的纯化

1.2.4.2 Bacillus subtilis SM98011所产蛋白酶纯酶的性质

1.3 讨论

第二章 MCP-01和BP-01的结构分析

2.1 材料与方法

2.1.1 试验材料

2.1.2 试验方法

2.2 结果和分析

2.2.1 BP—01的基因克隆

2.2.1.1 编码BP—01活性中心保守片段S1的DNA片段克隆和测序

2.2.1.2 BP—01基因的克隆和氨基酸序列推导

2.2.2 MCP—01与BP—01的一级结构比较

2.2.3 MCP-01和BP-01的同源模建三维结构比较分析

2.2.4 MPC-01和BP-01在溶液中的结构分析

2.2.4.1 荧光光谱分析

2.2.4.2 园二色光谱分析

2.2.4.3 MCP-01和BP-01的变构温度测定

2.2.5 蛋白酶的抑制剂对BP—01和MCP—01结构的影响

2.3 讨论

第三章 MCP-01和BP-01构象与功能的关系

3.1 材料和方法

3.1.1 试验材料

3.1.2 试验方法

3.2 结果和分析

3.2.1 MCP—01和BP—01在盐酸胍溶液中的构象和功能

3.2.1.1 MCP—01在盐酸胍溶液中构象的变化

3.2.1.2 BP—01在盐酸胍中构象的变化

3.1.2.3 MCP—01和BP—01在盐酸胍中构象和功能的关系

3.2.2 MCP-01和BP-01在不同缓冲系统中的构象和功能

3.2.2.1 不同缓冲系统对MCP-01的最适酶活温度及稳定性的影响

3.2.2.2 不同缓冲系统对BP-01的最适酶活温度及稳定性的影响

3.2.2.3 MCP-01和BP-01在不同缓冲系统中的构象

3.2.2.4 MCP—01和BP—01在不同缓冲液中热稳定性的变化

3.2.3 MCP-01和BP-01在TFE溶液中的构象和功能

3.2.3.1 MCP-01在TFE溶液中构象的变化

3.2.3.2 BP-01在TFE溶液中构象的变化

3.2.3.3 MCP—01和BP—01在TFE中构象和功能的关系

3.2.4 不同浓度TMAO对MCP-01和BP-01构象和功能的影响

3.2.4.1 TMAO对MCP-01和BP-01构象的影响

3.2.4.2 TMAO对MCP-01和BP-01酶活力的影响

3.2.5 TFE和TMAO对MCP-01和BP-01稳定性的影响

3.2.5.1 保温过程中MCP—01和BP—01构象的变化

3.2.5.2 MCP-01变性过程中热力学参数的测定

3.3 讨论

第一部分 总结

第二部分

第四章 MCP-01在冰鲜品增鲜中的应用

4.1 材料与方法

4.1.1 主要材料、试剂和仪器

4.1.2 实验方法

4.2 结果和分析

4.2.1 MCP-01和BP-01的酶学特性比较

4.2.2 MCP-01和BP-01对冰鲜品酶解增鲜作用的比较

4.2.3 MCP-01和BP-01处理后冰鲜品中风味氨基酸的变化

4.2.4 MCP-01和BP-01处理后必需氨基酸的变化

4.3 讨论

第五章 富含ACE抑制肽的海洋蛋白酶解物的高通量筛选

5.1 材料与方法

5.1.1 材料

5.1.2 实验方法

5.2 结果和分析

5.2.1 用毛细管电泳分析ACE抑制剂的抑制活力

5.2.2 毛细管电泳的方法快速测定海洋蛋白酶解产物的ACE抑制活力

5.3 讨论

第六章 新型ACE抑制肽的分离纯化、结构鉴定及机理分析

6.1.材料和方法

6.1.1 试验材料

6.1.2 实验方法

6.2 结果和分析

6.2.1 从中国毛虾的酶解产物中分离纯化ACE抑制肽

6.2.1.1 用超滤方法从中国毛虾酶解液中分离ACE抑制组分

6.2.1.2 通过分子筛层析从超滤液中分离纯化ACE抑制组分

6.2.1.3 应用HPLC从峰Ⅱ，峰Ⅲ和峰Ⅳ中纯化ACE抑制肽

6.2.2 ACE抑制肽的氨基酸序列鉴定

6.2.3 三种新型ACE抑制肽的抑制活性和机理研究

6.3 讨论

第七章 中国毛虾高值化酶解综合利用技术的研究

7.1 材料和方法

7.1.1 试验材料

7.1.2 试验方法

7.2 结果和分析

7.2.1 中国毛虾营养成分分析

7.2.2 毛虾酶解利用的工艺流程

7.2.3 海洋毛虾酶解条件研究

7.2.3.1 蛋白酶的用量

7.2.3.2 酶解时间

7.2.4 中国毛虾酶解产物的特性研究

7.2.4.1 中国毛虾酶解液感观分析

7.2.4.2 中国毛虾酶解液氨基酸和肽含量的分析

7.2.4.3 中国毛虾酶解液抗氧化活性和ACE抑制活性的评价

7.2.4.4 利用中国毛虾酶解残渣分离制备甲壳素和壳聚糖及其特性分析

7.3 讨论

第八章 中国毛虾酶解利用的中试和工业化生产

8.1 材料和方法

8.1.1 试验材料

8.1.2 实验方法

8.2 结果和分析

8.2.1 中温蛋白酶BP-01的中试生产

8.2.2 中国毛虾酶解利用的中试及工业化生产技术

8.2.2.1 中国毛虾酶解利用的中试生产技术

8.2.2.2 中国毛虾酶解利用的工业化生产技术

8.2.3 中国毛虾中试和工业化生产的产品组成分析与功能评价

8.2.3.1 中国毛虾小试、中试和工业化生产酶解产品肽组成的比较

8.2.3.2 中国毛虾酶解液、浓缩液和干粉的肽谱分析

8.2.3.3 中国毛虾中试和工业化酶解利用的产品的ACE抑制活性

8.3 讨论

第二部分 总结

参考文献

创新性结果

在读博士期间发表的论文

致谢

学位论文评阅及答辩情况表

发布时间: 2005-10-17

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