犬冠状病毒的分离鉴定及其S基因的克隆

论文摘要

2006年3月,公安部警犬技术学校2只警犬发病,经初步诊断后,疑似犬冠状病毒（CCV）病。我们对提供的犬冠状病毒（CCV）症状病犬的粪便,以犬肾传代细胞（MDCK）等多种细胞进行了病毒分离,结果分离到1株病毒,在荧光显微镜下观察到犬冠状病毒的特征,进而对该病毒进行了形态学、理化学、生物学鉴定以及RT-PCR鉴定等方面研究。最后将分离得到的CCV病毒S基因克隆到相应载体中构建重组质粒,这对进一步研究CCV病毒的原核表达工作以及基因疫苗的研制工作提供了必要的信息和资料,实验设计及结果为:1.从犬冠状病毒（CCV）症状病犬粪便中分离出一株病毒,采用物理化学实验、动物回归实验等方法进行鉴定。实验结果为:细胞培养证实该病毒有致细胞病变效应;物理化学鉴定结果表明,分离病毒核酸类型为RNA,对氯仿、乙醚敏感,对1%胰蛋白酶不敏感,耐酸性较强,具有一定的耐热性,无血凝性和红细胞吸附特性;中和试验证明该分离病毒是一种犬冠状病毒;动物回归实验表明,本次分离病毒株可以引起试验犬出现典型犬冠状病毒病症状。2.合成通用引物（2Bp,4Bm）和Matthew等设计的CCV S基因区特异性引物（CCVF2,CCVR2）对分离病毒进行RT—PCR反应及限制性内切酶BstXⅠ酶切鉴定,并将纯化的PCR产物成功地克隆到pGEM-T-easy载体中。结果为:通用引物（2Bp,4Bm）和特异性引物（CCVF2,CCVR2）扩增均得到预期片段250bp,以及514bp,并且BstXⅠ酶切CCVF2、CCVR2的PCR产物,于琼脂糖凝胶上可见到大小为187 bp和327 bp两个核苷酸片段。回收引物CCVF2,CCVR2扩增得到长度约为514 bp较亮的DNA片段,并将其直接克隆到pGEM-T-easy载体中,转化E. coli JM109,并扩增培养,对重组质粒采用CCV特异性引物（CCVF2,CCVR2）进行PCR,得到预期扩增片段514bp,测序结果与GenBank的CCV序列进行比对,与之相符。结论:1.形态学、理化学、生物学及动物回归实验等多方面鉴定,证明所分离病毒为犬冠状病毒.RT-PCR反应结果,BstXⅠ酶切鉴定均得到预计扩增片段,证明所分离病毒为犬冠状病毒.2.回收犬冠状病毒特异性引物CCVF2,CCVR2扩增的S蛋白特异性基因片断并将其克隆入pGEM-T-easy载体中,进行PCR鉴定及测序,结果表明成功构建了pGEM-T-easy/CCV重组质粒.3.S基因序列分析比较发现,分离培养出的CCV病毒和CCV TN-449株（AY878318.1）同源性非常高,以目前所测定的序列比较达到了100%.

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 犬冠状病毒分离鉴定研究进展
• 1.1 病源
• 1.2 流行病学
• 1.3 分离鉴定研究进展
• 1.3.1 病原学检查
• 1.3.2 血清学检查
• 1.3.3 实验室诊断鉴定注意问题
• 1.4 临床存在问题
• 1.4.1 CCV 的毒力问题
• 1.4.2 CCV 与宿主的关系问题
• 1.4.3 CCV 在犬病毒性肠炎中的地位不清楚
• 1.4.4 CCV 的致病机制需进一步探讨
• 1.4.5 疫苗免疫效果不确定
• 第二章 犬冠状病毒分子生物学研究进展
• 2.1 CCV 的形态学及基因组结构
• 2.2 复制与转录
• 2.3 病毒颗粒的组装与释放
• 2.4 CCV 在宿主细胞内的增殖
• 2.5 犬冠状病毒的结构蛋白基因
• 2.5.1 犬冠状病毒的主要结构蛋白基因
• 2.5.2 非结构蛋白及功能
• 2.6 CCV 受体
• 2.7 变异与重组
• 2.8 结束语
• 第三章 犬冠状病毒的分离及鉴定
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 试验结果
• 3.2.1 病毒分离培养结果
• 3.2.2 病毒理化特性检测结果
• 3.2.3 动物回归实验结果
• 3.3 讨论
• 3.3.1 病毒分离方法对分离效果的影响
• 3.3.2 犬感染冠状病毒的发病特点
• 3.3.3 关于病毒生物学鉴定
• 3.4 结论
• 3.4.1 病毒分离
• 3.4.2 病毒形态学，理化学、生物学以及动物回归实验
• 第四章 犬冠状病毒的RT-PCR 及其S 基因的克隆
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 试验结果
• 4.2.1 病毒分离培养结果
• 4.2.2 RT-PCR 扩增结果
• 4.2.3 酶切鉴定结果
• 4.2.4 重组质粒的鉴定
• 4.2.5 测序
• 4.3 讨论
• 4.3.1 关于冠状病毒通用引物和CCV 特异性引物以及BstXⅠ酶切鉴定
• 4.3.2 病毒RT-PCR 检测的必要性及提高效果的措施
• 4.3.3 S 基因克隆的重要性
• 4.3.4 CCV 病毒同源性分析
• 4.4 结论
• 参考文献
• 附录 1
• 附录 2
• 附录 3
• 致谢
• 作者简介