炭疽杆菌S-层基因sap和eag的功能研究

论文摘要

炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）简称炭疽杆菌,是能形成芽孢的革兰氏阳性杆菌；它可感染动物和人引起皮肤炭疽、肺炭疽和肠炭疽等。炭疽是五大人畜共患病之一,对畜牧业及人类健康的危害很大。在炭疽杆菌的毒力调控网络中除已知质粒pXO1和pXO2上的毒力基因外,在染色体上还存在一些与毒力相关的因子,曾有研究报道炭疽杆菌的S-层蛋白也可能是毒力因子。炭疽杆菌的S-层蛋白主要为表面排列蛋白（Surface array protein, Sap）和胞外抗原1（Extracellular antigen 1, EA1）,分别由sap和eag基因编码。为了研究炭疽杆菌S-层蛋白功能,本研究首先利用Cre/loxp系统在同源重组的原理下构建不带任何抗性标记的目的基因sap和eag的缺失突变株,在核酸水平及蛋白质水平上进行验证；然后,通过测定生长曲线、糖代谢及电镜观察菌体表面形态来比较说明缺失基因后是否影响炭疽杆菌A16R的生理生化表型：通过不同的动物模型评价A16R与其突变株的毒力差异；利用双向电泳技术比较A16R与突变株间的差异蛋白,通过质谱鉴定差异蛋白,分析缺失基因后对A16R其他蛋白的影响。主要结果如下：1无抗性A16R△sap和双缺失突变株A16R△sap△eag的构建为了研究sap及eag基因的功能,敲除目的基因构建缺失突变株是研究的基础,本研究无痕（不带抗性标记）敲除的方法为后期疫苗的应用提供更广阔的空间。以炭疽杆菌疫苗株A16R为出发菌株,利用pKSV7穿梭质粒构建打靶载体,将其转入A16R中,同源重组筛选突变株A16R△sap::spc,再利用Cre/loxp系统在同源重组的原理下去除抗性基因,获得无痕sap突变株A16R△sap;同样的方法构建了双缺失△sap△eag突变株A16R△sap△eag。2 sap或eag基因单/双缺失株生理生化和S-层结构的分析为了分析sap和eag基因对A16R的生理生化或表型的影响,比较A16R及其突变株生长曲线、49种糖代谢情况发现,sap或eag基因单/双缺失后对A16R的生理生化方面没有影响,而通过透射电镜观察菌体S-层结构发现在双缺失sap和eag基因后A16R不形成S-层,两个单缺失株形成的S-层结构分别比A16R薄7nm或19nm。3应用动物模型对A16 R与其突变株的毒力进行评价为了验证sap和eag基因是否为毒力相关基因,通过动物模型的攻毒实验能直观的体现出缺失基因后的毒力变化,A16R及其突变株的芽孢和繁殖体攻毒不同动物实验结果均说明炭疽杆菌S-层基因eag缺失使A16R毒力明显减弱,而sap基因缺失后对A16R毒力没有影响。4 A16R与其突变株的比较蛋白质组学研究制备A16R及其突变株各个时相的全菌体蛋白样品,完成其pH4-7梯度的双向电泳图谱,比较双向图谱中的差异蛋白点,共获得207个差异点,缺失S-层基因sap或eag后主要影响的功能蛋白为能量合成和转换相关的蛋白；通过比较蛋白质组学鉴定到的差异蛋白中未发现其他与毒力相关的蛋白。质谱鉴定到炭疽杆菌假想S-层蛋白BA3338；当缺失sap基因后,BA3338表达量在对数期时明显上调,当缺失eag基因后,对数末期时BA3338的表达量一个上调一个下调,而稳定期及衰亡期其表达均上调；因Sap和EA1表达具有时相性,即对数期时主要表达的S-层蛋白为Sap,进入稳定期后EA1为主要的S-层蛋白；说明BA3338随着时相的改变其蛋白功能互补了Sap和EA1的蛋白功能。双缺失菌株未鉴定到BA3338的表达变化。A16R与A16R△asp△eag双向电泳图谱比较发现在双缺失Sap和EA1蛋白后有两个关于芽孢形成的蛋白（Ad07,Ad18）发生了缺失,而在培养双缺失株的芽孢时并未见其形成芽孢的能力发生改变；说明在A16R中这两个蛋白的缺失并不影响芽孢的形成。动物攻毒实验和比较蛋白质组学分析A16R及其突变株的差异蛋白结果均可以认定eag是炭疽杆菌的一个毒力相关因子,而sap仅作为结构基因表达Sap蛋白构成炭疽杆菌的S-层结构。本研究不仅为炭疽杆菌S-层基因功能研究提供依据,更重要的是促进安全有效的炭疽杆菌疫苗的研制,并有助于完善治疗方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 炭疽杆菌的简介
• 1.1 炭疽杆菌的致病因素与致病机理
• 1.2 炭疽杆菌的S-层蛋白
• 2 炭疽芽孢杆菌疫苗的研究现状
• 3 炭疽杆菌的动物实验模型
• 4 炭疽杆菌蛋白质组学研究
• 5 本研究的目的与意义
• 第二章 炭疽杆菌A16R/Δsap及A16RΔsapΔeag的构建
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 重组质粒的构建
• 2.2 重组质粒转炭疽杆菌A16R的验证
• 2.3 A16RΔsap::spc突变株的验证
• 2.4 A16RΔsap::spc去抗性验证
• 2.5 重组质粒pKeag2转入A16RΔsap的验证
• 2.6 A16RΔsapΔeag::spc验证
• 2.7 质粒pCrePA去除A16RΔsapΔeag::spc的抗性
• 2.8 western blot验证
• 3 小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.2 讨论
• 第三章 A16R及其突变株的生理生化及表型比较
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 生长曲线
• 2.2 A16R及其突变株糖代谢实验
• 2.3 S-层结构的比较
• 3 小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.2 讨论
• 第四章 A16R及其突变株的毒力评价
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 芽孢和繁殖体计数及染色结果
• 2.2 动物攻毒实验
• 3 小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.2 讨论
• 第五章 A16R及其突变株的比较蛋白质组学研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 不同时相各菌株菌体蛋白样品的双向电泳图谱
• 2.2 差异蛋白质鉴定
• 2.3 鉴定的差异蛋白质在细胞中的定位情况
• 2.4 鉴定的蛋白质功能分类分析
• 2.5 各时相不同菌株差异点的表达情况分析
• 3 小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.2 讨论
• 第六章 总结和展望
• 1 总结
• 2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 各种试剂盒使用步骤
• 附录2 实验中所用仪器设备
• 附录3 实验中所用试剂
• 附录4 培养基及溶液的配制
• 附录5 重组载体pKsap的构建流程
• 附录6 双向电泳图谱
• 附录7 炭疽杆菌双向电泳图谱中所鉴定蛋白质点的相关信息