枯草芽孢杆菌弹性蛋白酶的纯化及酶学性质的研究

论文摘要

弹性蛋白酶是一种以水解不溶性弹性硬蛋白为特征的广谱蛋白水解酶。可以由动物胰脏提取,也可以由微生物发酵生产。由于其广谱的蛋白水解活性,不仅在医疗上有其应用价值,而且在食品、日用化工品工业上也有着广阔的应用前景和较高的商业价值。在优化的培养条件基础上,本实验应用柱层析和凝胶电泳分离纯化了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）弹性蛋白酶,研究了该酶的酶学性质,并探讨了枯草芽孢杆菌弹性蛋白酶、胰弹性蛋白酶和木瓜蛋白酶对常见肉类蛋白质的降解作用及嫩化效果。主要结论如下:1.发酵液经过硫酸铵分段盐析、透析和Sephadex G-100凝胶过滤柱层析,得到两个洗脱峰,将两个波峰产物分别收集浓缩,经活性检测发现波峰二有较高的弹性蛋白酶酶解活性,SDS-PAGE结果表明,该产物是分子量约30KDa的单一条带。此外,1mmol/L浓度的Ca2+在酶的纯化过程中起到较好的稳定酶活的作用,而关于Ca2+应用于弹性蛋白酶的纯化方法的研究,国内外文献还未见报道。2.枯草芽孢杆菌弹性蛋白酶的最适作用温度为50℃,且能耐受高温,将此酶于60℃处理4h后,酶活仅下降了35%。该酶在pH8～11之间酶活力趋于稳定,但在pH5时出现一个拐点;同时,在不同类型缓冲液中,酶的最适pH值不同:在硼砂-硼酸缓冲体系中为pH7.4,在Tris-HCl缓冲体系中为pH8.6。0.3mmol/L Na+对酶活有微弱的激活作用;3mmol/L的Ca2+和Zn2+对酶活有明显的促进作用,且Ca2+效果更显著;Li+、K+、Ba2+、Mg2+和Mn2+对酶活均有不同程度的抑制作用,金属离子浓度越高,抑制作用越强;在酶反应系统中,添加金属离子鳌合剂EDTA,它对酶活的抑制作用随浓度的增加而加强,当EDTA达到50mmol/L时,对酶活有显著的抑制作用,酶活仅为原有的17%。3.对枯草芽孢杆菌弹性蛋白酶酶促水解条件进行了探讨,不同酶浓度下酶解动力学过程发生了明显改变,高酶浓度下可以显著提高弹性蛋白的降解率;不同底物添加量的水解过程也有所不同,过高或过低底物添加量都不利于弹性蛋白的水解。该弹性蛋白酶的米氏常数Km为0.0057g/ml,最大反应速度Vmax为0.0308U/ml,催化动力学方程为:V=0.0308[S]/0.0057+[S]。4.枯草芽孢杆菌弹性蛋白酶、胰弹性蛋白酶可以不同程度的降解弹性蛋白、干酪素、明胶和牛血清白蛋白。木瓜蛋白酶也能够降解除弹性蛋白以外的其他蛋白质。同时,通过比较以上三种酶对富含弹性蛋白的牛肉、牛肚、牛筋、猪肉和猪皮五种肉类蛋白质的水解情况发现:枯草芽孢杆菌弹性蛋白酶降解肉类蛋白质的效果最好,其次是胰弹性蛋白酶,效果最差的是木瓜蛋白酶,而木瓜蛋白酶对牛筋几乎不水解。剪切力测试和感官评价结果也证明了这一结论。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 弹性蛋白酶降解弹性蛋白
• 1.1.1 弹性蛋白的性质与结构
• 1.1.2 弹性蛋白酶作用弹性蛋白的机理
• 1.2 弹性蛋白酶的分布
• 1.2.1 动物来源的弹性蛋白酶
• 1.2.2 微生物来源的弹性蛋白酶
• 1.2.3 利用基因工程技术获得弹性蛋白酶
• 1.3 弹性蛋白酶的提取
• 1.3.1 动物源性弹性蛋白酶的提取
• 1.3.2 微生物源弹性蛋白酶的提取
• 1.4 微生物源弹性蛋白酶酶学性质的研究概述
• 1.5 弹性蛋白酶的应用
• 1.5.1 弹性蛋白酶在医药方面的应用
• 1.5.2 弹性蛋白酶在食品工业的应用
• 1.5.3 弹性蛋白酶在日用化工方面的应用
• 1.5.4 弹性蛋白酶在生物防治方面的应用
• 1.6 研究目的和意义
• 第二章 枯草芽孢杆菌弹性蛋白酶的纯化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 盐析
• 2.2.2 SephadexG-100凝胶柱层析
• 2.2.3 SDS-PAGE
• 2.2.4 纯化效果的评价
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 枯草芽孢杆菌弹性蛋白酶的酶学性质
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 酶的最适作用温度和对热的稳定性
• 3.2.2 酶的最适作用pH和对酸碱的稳定性
• 3.2.3 金属离子对酶活力的影响
• 3.2.4 表面活性剂对酶活力的影响
• 3.2.5 有机溶剂对酶活力和热稳定性的影响
• 3.2.6 抑制剂对酶活力的影响
• 3.2.7 弹性蛋白酶酶促动力学研究
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 枯草芽孢杆菌弹性蛋白酶的应用
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 菌源性弹性蛋白酶对弹性蛋白的亲和吸附作用
• 4.2.2 菌源性弹性蛋白酶对弹性蛋白分解的特性
• 4.2.3 三种蛋白酶对天然蛋白质的分解特性
• 4.2.4 三种蛋白酶对几种肉类蛋白质的分解特性
• 4.2.5 三种蛋白酶对肉类蛋白质嫩化的研究
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 第五章 全文结论及建议
• 5.1 全文结论
• 5.2 本研究的不足及建议
• 参考文献
• 致谢
• 在读硕士学位期间发表的研究论文