论文摘要
β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactoside galactohydrolase, EC 3.2.1.23)通常被称为乳糖酶(Lactase)。该酶可将乳糖水解成为半乳糖与葡萄糖,同时也具有半乳糖苷的转移作用。β-半乳糖苷酶主要应用在生产低乳糖乳制品以及缓解绝大多数亚洲人食用乳制品时造成的乳糖吸收不良和乳糖不耐受的问题。但目前在我国乳糖酶的应用还未得到广泛推广,主要原因就是乳糖酶产量低,销售价格过高,应用成本昂贵,不能满足食品和乳制品工业的需要。而基因工程技术的发展,为研制出产量高、酶学性质优良、工艺简便、成本低、更适合食品工业生产的乳糖酶提供了有效的途径。本试验利用基因工程技术,构建真核表达载体pPIC9-cDNA,并且利用毕赤酵母表达系统成功的高效分泌表达了来源于亮白曲霉的乳糖酶,表达量达6g/L。在此基础上对高表达菌株的插入位点进行了鉴定,结果显示1#、7#初步认为整合方式相同,并且与25#整合方式不同,这为寻找高表达的菌株与插入位点之间的关系,为获得高表达菌株奠定理论基础。同时在小试水平对乳糖酶的发酵工艺进行了研究和优化,成功的摸索出乳糖酶发酵的最佳条件为10%接种量,温度30℃,pH5.2,菌体生长时间24~28h,甲醇添加量由DO控制,诱导方式首先采取了葡萄糖-甲醇混合物进行过渡期,随后是甲醇诱导的方式,这将为乳糖酶大规模工业化生产提供借鉴。最后,根据乳糖酶发酵液中颜色较深,盐浓度高等特点和后期纯化工艺的要求,选择了膜分离技术来处理发酵液,其中主要从微滤提取、超滤浓缩两步操作过程对酶活性的影响进行了研究,就超滤而言,温度25℃,操作压力小于0.12MPa,浓缩倍数10倍时,酶活损失最少,膜最容易清洗。
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摘要Abstract1 引言1.1 乳糖酶1.1.1 乳糖酶来源1.1.2 β-半乳糖苷酶的应用1.1.3 真核基因表达系统1.2 重组酵母菌的高密度发酵表达1.2.1 pH 值的控制1.2.2 温度对发酵的影响1.2.3 溶氧对发酵的影响1.3 膜工程1.3.1 膜材料1.3.2 膜分离技术的分类1.3.3 膜组件结构1.3.4 膜分离技术的应用1.3.5 膜的污染与清洗1.4 本课题研究意义2 实验一 乳糖酶基因真核重组表达载体的构建2.1 材料与方法2.1.1 材料2.1.2 方法2.2 结果与分析2.2.1 载体构建图2.2.2 载体和片段的制备结果2.2.3 重组质粒pPIC9-cDNA 酶切鉴定结果2.2.4 重组酵母转化子的筛选2.3 讨论2.3.1 甲醇营养型酵母表达系统的优点2.3.2 重组质粒pPIC9-cDNA 线性化的原因2.3.3 巴斯德毕赤酵母的转化方法的选择2.3.4 毕赤酵母发酵培养基的选择2.4 小结3 实验二 重组毕赤酵母阳性转化子的分子检测3.1 材料与方法3.1.1 材料3.1.2 方法3.2 结果分析3.2.1 重组酵母中乳糖酶基因 PCR 鉴定3.2.2 重组酵母转化子的 Southern blotting 分析3.3 讨论3.3.1 PCR 和Southern 鉴定的选择3.3.2 膜的选择3.3.3 转移方法的选择3.4 小结4 实验三 乳糖酶发酵工艺的摸索4.1 材料与方法4.1.1 材料4.1.2 实验方法4.2 结果分析4.2.1 发酵罐接种量对发酵的影响4.2.2 最佳补糖时间的确定4.2.3 菌体浓度的测定结果4.2.4 菌体湿重的测定结果4.2.5 乳糖酶活性的检测4.2.6 发酵上清 SDS-PAGE4.3 发酵讨论4.3.1 毕赤酵母培养基碳源确定4.3.2 种子扩增4.3.3 发酵条件对产酶的影响4.3.4 甲醇的诱导方式4.4 小结5 实验四 发酵液后处理5.1 材料与方法5.1.1 材料5.1.2 实验方法5.1.3 0.2μm 和20kD 中空纤维组件清洗步骤5.2 结果分析5.2.1 0.2μm 中空纤维组件膜通量随过滤时间的变化5.2.2 20kD 中空纤维组件处理乳糖酶发酵过程中适宜浓缩倍数的确定5.2.3 两种膜清洗结果5.3 讨论5.3.1 中空纤维组件的选择5.3.2 0.2μm 膜的选择5.3.3 20kD 膜的选择5.4 小结6 结论致谢参考文献作者简介
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乳糖酶基因在毕赤酵母中的表达鉴定、发酵工艺优化及发酵液后处理的研究
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