Smydl基因在心肌肥大中的调控作用

论文摘要

心肌肥大是一种渐进性的心脏疾病,是心肌层的一般反应,发生在不同的心血管疾病中,如高血压、心肌梗塞、心房室瓣疾病,以及基因、病毒或代谢引起的不同心肌病。高达50%左右的心肌肥大患者在患病5年内都会因心力衰竭而导致死亡。尽管几十年来有关心肌肥大发生的研究已取得进展,但其分子机制远未阐明。为了阐明心肌肥大发生的分子机制,本研究室前期克隆了一个在心脏和肌肉组织中特异表达人类基因Smyd1 （又名为肌肉特异性Bop基因）,发现该基因可能与心肌肥大的发生有关。本文基于前期研究结果,继续深入研究Smyd1在心肌肥大发生中的调控作用。我们首先建立了一批异丙肾上腺素（ISOprenaline,简称ISO）诱导BALBc小鼠病理性心肌肥大模型,对这批小鼠模型的特征进行了分析,证明这些小鼠确实是病理性心肌肥大小鼠。利用这批小鼠模型进一步研究Smyd1基因是否与心肌肥大的发生有关。Western检测结果表明,Smyd1蛋白在病理性肥大小鼠心脏组织中的表达上调。为了研究Smyd1基因是否与生理性心肌肥大的发生有关,我们对小鼠进行定时定期游泳训练,建立了BALBc小鼠生理性心肌肥大模型。Western检测结果显示,Smyd1蛋白在小鼠生理性肥大心脏组织的表达和正常对照的小鼠差异不明显。本文也利用分离的原代新生大鼠心肌细胞研究Smyd1基因与心肌肥大发生的关系。用胎牛血清刺激新生大鼠心肌细胞,细胞发生肥大,而Smyd1的mRNA水平的表达也明显上调。这些结果初步表明Smyd1可能参与病理性心肌肥大的信号调控途径,但与生理性心肌肥大的发生无关。同时,本文构建了Smyd1基因H9C2大鼠心肌细胞过表达稳定系和干扰稳定系进行基因的分子调控机制研究。免疫荧光实验显示,在Smyd1过表达稳定系中,Smyd1的表达明显高于对照。心脏肥大标记基因β-MHC、SK-α-Actin和ANF在Smyd1过表达系中同样表达上调。而在干扰稳定系中,Smyd1的表达则显著低于对照。由此可以从细胞水平证实,Smyd1基因参与病理性心肌肥大。最后,我们用一组病理性肥大型心肌病的病人心脏样本研究Smyd1是否与病理性心肌肥大有关。Western检测结果显示,Smyd1蛋白在病理性肥大型心肌病的病人心脏样本中的表达上调,同在小鼠和细胞模型中的结果相同,表明Smyd1基因不仅在小鼠体内调控心肌肥大的发生,在人类心脏中也起着同样的作用。上述研究结果可以为心肌肥大病的发生机制研究及治疗提供初步的理论参考。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言和文献综述
• 1.1 引言及本文研究内容和意义
• 1.2 心脏的发生与发育
• 1.3 心脏诱导的研究
• 1.4 心肌肥大的概述
• 1.5 心肌肥大过程中的信号转导
• 1.6 刺激心肌肥大的主要因素
• 1.6.1 机械应力
• 1.6.2 神经激素因子介导机械应力诱导性心肌肥大
• 1.6.3 机械应力转化为生化信号诱导心肌肥大
• 1.6.4 其他因素引起心肌肥大
• 1.7 心肌肥大信号途径中的关键转录因子
• 1.8 RHA干扰（RNAI）技术
• 1.9 利用模式动物进行遗传学分析
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要实验仪器和耗材
• 2.1.3 质粒、细胞与菌株
• 2.1.4 生物信息学分析的主要软件与数据库
• 2.2 方法
• 2.2.1 异丙肾上腺素（ISO）刺激心肌肥大小鼠模型的制备
• 2.2.2 原代新生大鼠心肌细胞的分离和培养
• 2.2.3 细胞与心脏组织总RNA的提取
• 2.2.4 RT-PCR
• 2.2.5 PCR的扩增
• 2.2.6 PCR产物纯化与回收
• 2.2.7 DNA片段的连接
• 2.2.8 感受态细胞的制备
• 2.2.9 转化
• 2.2.10 少量质粒的制备
• 2.2.11 阳性克隆的筛选和鉴定
• 2.2.12 测序
• 2.2.13 真核表达质粒的大量提取
• 2.2.14 重组质粒的构建
• 2.2.15 常规的细胞培养及转染
• 2.2.16 转基因稳定表达细胞系的建立
• 2.2.17 动物和人类组织蛋白的提取与检测
• 2.2.18 SDS-PAGE凝胶电泳
• 2.2.19 Western blot免疫印记
• 2.2.20 siRNA技术
• 2.2.21 免疫组化技术（以石蜡切片为例）
• 2.2.22 免疫荧光技术
• 第三章 结果与分析
• 3.1 SMYD1基因的生物信息学分析
• 3.2 SMYD1基因在L-甲状腺素刺激的病理性肥大小鼠模型中的形态学表达研究
• 3.2.1 Smyd1基因在L-甲状腺素刺激的病理性肥大小鼠模型中的蛋白水平上的表达研究
• 3.2.2 Smyd1基因在L-甲状腺素刺激的病理性肥大小鼠模型中的RNA水平上的表达研究
• 3.3 SMYD1基因在异丙肾上腺素（ISO）刺激的病理性肥大小鼠模型中的形态学表达研究
• 3.3.1 Smyd1基因在异丙肾上腺素（ISO）刺激的病理性肥大小鼠模型中的蛋白水平上的表达研究
• 3.3.2 Smyd1基因在异丙肾上腺素（ISO）刺激的病理性肥大小鼠模型中的RNA水平上的表达研究
• 3.4 SMYD1基因在生理性心肌肥大小鼠模型中的表达研究
• 3.5 SMYD1基因在原代新生大鼠心肌细胞中的表达研究
• 3.6 SMYD1过表达系分析SMYD1在心肌肥大中的作用
• 3.6.1 免疫荧光分析Smyd1在过表达细胞系中的表达
• 3.6.2 心肌肥大标记基因在Smyd1过表达细胞系中的表达上调
• 3.7 利用SMYD1干扰细胞系分析SMYD1在心肌肥大中的作用
• 3.7.1 RNiA的设计与合成以及重组干扰质粒的构建
• 3.7.2 Smydl干扰细胞转染和筛选与鉴定
• 3.7.3 Smyd1基因在Smyd1干扰细胞系中的表达显著下降
• 3.8 SMYD1基因在肥大人类心脏中的表达初步研究
• 第四章 讨论
• 第五章 结语
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 感谢