鸡蛋卵白蛋白酶解物抗氧化肽研究

论文摘要

鸡蛋是人类摄取营养物质的一种重要来源，几乎包含了胚胎发育所需的所有蛋白质、脂质、维生素、矿物质和生长因子。鸡蛋中的蛋白质主要存在于蛋清和蛋黄中，其中蛋清蛋白的种类和含量最为丰富。卵白蛋白是蛋清中的主要蛋白质，占蛋清蛋白质的54％，是获得生物活性肽的很好资源。本文以鸡蛋卵白蛋白为对象，采用生物酶解、抗氧化试验、离子色谱、反相高效液相色谱、电喷雾质谱等方法，系统研究了酶水解各主要参数，酶解物抗氧化活性，抗氧化肽的分离纯化和结构表征，为开发鸡蛋抗氧化肽产品提供理论基础。主要结果如下： 1．获得了简便、快速、高纯度的鸡蛋卵白蛋白提取工艺路线。采用Q-Sepharose FF阴离子色谱法对鸡蛋卵白蛋白进行分离。通过对蛋清上样量、缓冲液pH值、缓冲液浓度和洗脱液离子强度等优化试验，获得的工艺条件为：鸡蛋蛋清用2倍的水稀释，将其pH调至6.0沉淀去除卵粘蛋白，40mLQ-Sepharose FF阴离子柱分离，蛋清上样量140mL，用0.15mol／L pH8.0的NaCl水溶液洗脱，可获得1058mg卵白蛋白，卵白蛋白的得率为55％，经反相高效液相色谱检测纯度为92％。 2．以羟自由基清除率为指标，研究了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶水解鸡蛋卵白蛋白所得酶解物的抗氧化活性。研究表明胃蛋白酶的酶解物羟自由基清除率最高。 3．确定了酶解物羟自由基清除率≥140％的酶解条件。采用响应曲面分析法对底物浓度[S]、胃蛋白酶添加量[E]、酶解时间进行分析，建立了回归模型，确定了酶解条件，即底物浓度2.22％-3.76％、酶添加量8738.24u／g-11176.63u／g、水解时间4.05-7.77h。 4．首次采用多种抗氧化活性试验，全面研究了鸡蛋卵白蛋白酶解物的抗氧化活性。体外试验结果表明：酶解物对碱性邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子、Fenton反应产生的羟基自由基、亚油酸氧化体系中亚油酸的氧化均有明显的抑制作用，且呈现一定的量效关系。5mg／mL的鸡蛋卵白蛋白酶解物，对超氧阴离子的抑制率为45％，对羟基自由基清除率为56％，对亚油酸氧化的抑制能力相当于0.2mg／mL VE的抑制能力，均显著高于同浓度的卵白蛋白的抑制能力（p＜0.05）。D-半乳糖复制衰老小鼠模型的体内抗氧化试验的研究结果表明：高、中剂量的鸡蛋卵白蛋白酶解物能极显著抑制衰老小鼠血清和肝脏中SOD、GSH-Px、CAT和T-AOC活性的下降（p＜0.01）；同时能极显著降低衰老小鼠血清和肝脏MDA的水平（p＜0.01）。

论文目录

• 第一章 前言
• 1 鸡蛋清生物活性肽研究状况
• 1.1 鸡蛋清的化学组成
• 1.1.1 鸡蛋的组成
• 1.1.2 蛋清中蛋白质组成及生物学性质
• 1.2 鸡蛋清生物活性肽研究
• 1.2.1 抗菌肽
• 1.2.2 免疫肽
• 1.2.3 降压肽
• 1.2.4 抗氧化肽
• 2 人体的氧化伤害和防御
• 2.1 人体内自由基产生的机制
• 2.2 自由基造成的氧化损伤
• 2.2.1 对脂类的伤害
• 2.2.2 对蛋白质的损害
• 2.2.3 对核酸的伤害
• 2.2.4 对糖类的伤害
• 2.3 机体自由基的清除
• 2.3.1 体内抗氧化酶
• 2.3.2 体内抗氧化剂
• 2.4 外源性抗氧化剂及其对自由基代谢的影响
• 2.4.1 维生素类抗氧化剂
• 2.4.2 植物提取物类抗氧化剂
• 2.4.3 微量元素类抗氧化剂
• 2.4.4 蛋白质、肽类、氨基酸的抗氧化活性
• 3 抗氧化肽研究进展
• 3.1 抗氧化肽的来源及抗氧化活性
• 3.1.1 天然抗氧化肽
• 3.1.2 人工合成抗氧化肽
• 3.1.3 蛋白质水解产生抗氧化肽
• 3.2 抗氧化能力的测定
• 3.2.1 抗脂类物质过氧化法
• 3.2.2 测定抗氧化剂清除自由基能力的方法
• 3.3 抗氧化肽的分离纯化与分析
• 3.3.1 抗氧化肽的分离纯化
• 3.3.2 抗氧化肽分析
• 3.4 抗氧化肽的应用前景
• 4 本研究课题的立题背景、研究意义和主要研究内容
• 4.1 立题背景、研究意义
• 4.2 主要研究内容
• 4.2.1 鸡蛋卵白蛋白的制备
• 4.2.2 鸡蛋卵白蛋白的酶水解研究
• 4.2.3 鸡蛋卵白蛋白水解产物的抗氧化性研究
• 4.2.4 鸡蛋卵白蛋白抗氧化肽的分离纯化及分析
• 第二章 鸡蛋卵白蛋白的制备
• 1 材料与仪器
• 1.1 试验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 2 试验方法
• 2.1 蛋清的制备
• 2.2 卵白蛋白分离
• 2.2.1 离子柱制备
• 2.2.2 分离
• 2.2.3 柱分离条件的选择
• 2.3 蛋白质检测
• 2.3.1 紫外吸收法
• 2.3.2 反相高效液相（RP－HPLC）色谱法
• 2.3.3 SDS－聚丙烯酰胺凝胶不连续电泳（SDS－PAGE）鉴定
• 2.4 数据统计与分析
• 3 结果与分析
• 3.1 Q－Sepharose FF 对鸡蛋卵白蛋白吸附量的影响
• 3.1.1 Q-Sepharose FF 对鸡蛋蛋清蛋白吸附量的影响
• 3.1.2 上样量对 Q-Sepharose FF 柱吸附鸡蛋卵白蛋白的影响
• 3.2 不同离子强度洗脱液对鸡蛋卵白蛋白洗脱效果的影响
• 3.3 最优柱分离条件的优化
• 4 讨论
• 5 小结
• 第三章 鸡蛋卵白蛋白的酶法水解研究
• 1 材料与仪器
• 1.1 试验材料
• 1.2 试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 试验方法
• 2.1 卵白蛋白的酶解
• 2.1.1 酶的筛选实验
• 2.1.2 胃蛋白酶水解鸡蛋卵白蛋白的单因素试验
• 2.1.3 最佳酶解条件的优化
• 2.2 测定方法
• 2.2.1 蛋白酶活力测定
• 2.2.2 蛋白质水解度的测定
• 2.2.3 总氮测定
• 2.2.4 氨基氮测定
• 2.2.5 酶解液清除OH的测定（脱氧核糖法）
• 2.3 数据统计与分析
• 3 结果与分析
• 3.1 不同蛋白酶对鸡蛋卵白蛋白水解度（DH）的影响
• 3.2 胃蛋白酶对鸡蛋卵白蛋白水解单因素试验
• 3.2.1 底物浓度对卵白蛋白水解的影响
• 3.2.2 不同酶用量对卵白蛋白水解的影响
• 3.3 酶解条件的优化
• 3.3.1 卵白蛋白胃蛋白酶水解物清除羟自由基试验分析与回归方程建立
• 3.4.2 卵白蛋白胃蛋白酶水解工艺条件的优化和回归模型的检验
• 4 讨论
• 5 小结
• 第四章 鸡蛋卵白蛋白酶解物抗氧化活性研究
• 1 材料与仪器
• 1.1材料
• 1.2主要试剂
• 1.3实验动物
• 1.4主要仪器设备
• 2 试验方法
• 2.1 鸡蛋卵白蛋白酶解物体外抗氧化研究
• 2.1.1 鸡蛋卵白蛋白酶解物清除超氧阴离子作用
• 2.1.2 鸡蛋卵白蛋白酶解物清除羟自由基作用
• 2.1.3 鸡蛋卵白蛋白酶解物抗脂质过氧化作用
• 2.2 鸡蛋卵白蛋白酶解物体内抗氧化研究
• 2.2.1 动物分组及D－gal衰老小鼠模型的建立
• 2.2.2 样品采集
• 2.2.3 测定方法
• 2.3 数据统计与分析
• 3 结果与分析
• 3.1 鸡蛋卵白蛋白酶解物对自由基的清除作用
• 3.2 鸡蛋卵白蛋白酶解物抗脂质过氧化能力
• 3.3 卵白蛋白酶解物对小鼠体内SOD活性的影响
• 3.4 卵白蛋白酶解物对小鼠GSH－Px活性的影响
• 3.5 卵白蛋白酶解物对小鼠CAT活性的影响
• 3.6 卵白蛋白酶解物对小鼠T－AOC活性的影响
• 3.7 卵白蛋白酶解物对小鼠MDA活性的影响
• 4 讨论
• 5 小结
• 第五章 鸡蛋卵白蛋白抗氧化肽的纯化与鉴定
• 1 试验材料与仪器
• 1.1 试验原料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 2 试验方法
• 2.1 样品制备
• 2.2 酶解物抗氧化肽的分离
• 2.2.1 酶解物超滤分离
• 2.2.2 酶解物离子交换分离
• 2.2.3 酶解物RP－HPLC分离纯化
• 2.3 卵白蛋白抗氧化肽结构分析
• 2.4 抗氧化活性检测
• 3 结果与分析
• 3.1 酶解物抗氧化肽分离纯化
• 3.1.1 酶解物超滤分离
• 3.1.2 Q－Sepharose FF对酶解物离子分离
• 3.1.3 RP－HPLC分离
• 3.2 卵白蛋白抗氧化肽结构分析
• 4 讨论
• 5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 附录 1: 卵白蛋白一级结构
• 附录 2: 鸡蛋卵白蛋白抗氧化肽反相高效液相分离结果
• 附录 3: OPQ3－1 的肽段质谱图
• 附录 4: OPQ3－2 的肽段质谱图
• 附录 5: OPQ3－4 的肽段质谱图
• 附录 5: 查新报告
• 缩略语
• 致谢
• 攻读博士学位期间的研究成果及获奖情况