禽传染性支气管炎病毒基因双顺反子DNA疫苗及mRNA3的分子特性研究

论文摘要

1、本研究采用PCR扩增获取鸡的IL-2、IL-18基因,将其插入pMD18-T载体中进行测序鉴定。对含有S1、M、N目的基因的pIBVS1、pIBVM、pIBVN质粒进行测序分析。结果表明,IL-2、IL-18、S1、M、N基因全长分别为432bp、536bp、1671bp、678bp和1230bp,鉴定的目的基因正确。以pDsRed-Express-N1载体为骨架,以内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site）序列为连接元件构建绿色和红色荧光基因的双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red,转染Vero细胞后观察到绿色和红色荧光基因均获得表达。构建的pIRES-EGFP/Red载体含有卡那霉素抗性基因,比含有氨苄抗性的双顺反子载体具有更高的生物安全性,为今后开展各种病原微生物双顺反子DNA疫苗的研制提供研究工具。2、用S1、M、N基因与IL-2、IL-18基因分别替换pIRES-EGFP/Red质粒中的荧光基因,构建双顺反子表达质粒pIRES-S1/IL2、pIPES-M/IL2、pIRES-N/IL2、pIRES-S1/IL18、pIPES-M/IL18和pIRES-N/IL18及其单基因表达质粒,转染Vero细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测质粒在体外的表达。RT-PCR检测表明转染了重组质粒的Vero细胞中均能特异的扩增出S1、M、N和（或）IL-2、IL-18基因片段;间接免疫荧光检测表明,转染了重组质粒的细胞显示出黄绿色荧光,而转染了空质粒的细胞则没有显示出任何特异荧光。本研究为IBV结构基因和细胞因子双顺反子DNA疫苗免疫试验提供了材料。3、采用本课题组获得专利（专利号为200410081443.4）的质粒提取、纯化方法制备质粒,将质粒溶液（1mg/mL）与脂质体溶液（10mg/mL）等体积混合配制成DNA疫苗。将配制的DNA疫苗通过腿部肌肉多点注射7日龄非免疫雏鸡,28日龄加强免疫一次。分别在免疫前和免疫后7、14、21、28、35d采血检测ELISA抗体效价和外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的数量。二免后两周用IBV强毒进行攻毒。ELISA抗体水平结果显示:pIRES-S1/IL2、pIPES-M/IL2、pIRES-N/IL2疫苗组产生的抗体水平高于pIRES-S1、pIRES-M、pIRES-N疫苗组,在免疫后14-35d,差异显著（P＜0.05）;pIRES-M/IL18、pIPES-N/IL18疫苗组产生的抗体水平也高于pIpES-M、pIRES-N疫苗组,在免疫后14-35d,差异显著（P＜0.05）,pIRES-S1/IL2、pIRES-S1/IL18疫苗组产生的抗体水平与pIRES-S1+pIRES-IL2、pIRES-S1+pIRES-IL18疫苗组相比在免疫后21-35d差异显著（P＜0.05）:外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量检测结果显示:pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2疫苗组在免疫后7-28d,与pIRES-S1、pIRES-M、pIRES-N疫苗组相比差异显著（P＜0.05）,pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18疫苗组在免疫后14-28d CD3+、CD4+T、CD8+T淋巴细胞亚群的数量高于pIRES-S1、pIRES-M、pIRES-N疫苗组,差异显著（P＜0.05）。pIRES-S1/IL2、pIRES-S1/IL18疫苗组的CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量较pIRES-S1+pIRES-IL2、pIRES-S1+pIRES-IL18 DNA疫苗组高,但差异不显著（P＞0.05）。攻毒结果表明,双顺反子DNA疫苗组的保护率介于65%～85%,其中RES-S1/IL2、pIRES-S1/IL18疫苗组的保护率分别为85%和75%,高于混合质粒pIRES-S1+pIRES-IL2、pIRES-S1+pIRES-IL18 DNA疫苗组的70%和60%。其中pIRES-S1/IL2疫苗组的保护率85%高于灭活疫苗组的攻毒保护率75%。本研究研制出的IBV结构蛋白与IL-2、IL-18双顺反子DNA疫苗,为提高IBV DNA疫苗的免疫效率提供了新的途径。4、采用RT-PCR获取IBV E基因,用以替换pIRES-M/Red质粒中的红色荧光基因,构建双顺反子表达质粒pIRES-M/E,转染Vero细胞后进行表达检测。采用本论文第三章的方法制备DNA疫苗和进行动物免疫试验。结果表明:在免疫后7-35d,pIRES-M/E免疫组产生的抗体水平及外周血T淋巴细胞亚群数量高于pIRES-M组,但差异不显著（P＞0.05）;pIRES-M/E、pIRES-M组对强毒的攻击保护率分别为55%和40%,且低于灭活疫苗的攻毒保护率（75%）。本研究构建了IBV的M基因和E基因双顺反子DNA疫苗并对其免疫原性进行了研究,结果初步认为E基因对M基因免疫的协同作用不明显。5、采用RT-PCR方法对IBV mRNA3（3a3b3c）区域进行了克隆、测序及分子特性分析,测序表明3a3b3c片段大小为734bp,包含完整的3a、3b、3c（E）基因,与GenBank上公布的58株IBV毒株的相应序列的同源率介于78.2%～96.1%之间,与CK/CH/LGD/04II毒株和CK/CH/LSC/99I毒株的同源率最高（96.1%和95.9%）。对3a3b序列的RNA二级结构进行预测,结果表明两者具有相同的二级结构,但二级结构的稳定性存在差异。进一步构建3a3b的双荧光基因共表达质粒p3a3b-EGFP/Red,并对其IRES功能进行检测,结果没能检测到3a3b序列下游红色荧光基因的表达。本研究表明3a3b3c序列的分子特征与毒株的遗传变异存在相关性,为IBV的分子流行病学研究提供了新的途径。3a3b基因片段的内部核糖体进入位点功能要弱于脑心肌炎病毒的IRES序列,因此筛选高效的IRES序列用于新疫苗载体的构建还需要进一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 选题背景
• 1.禽传染性支气管炎研究概况
• 2.禽传染性支气管炎基因工程疫苗研究概况
• 3.细胞因子作为基因佐剂的研究进展
• 4.双顺反子质粒载体的国内外研究进展
• 5.禽传染性支气管炎病毒分子生物学及mRNA3分子特性研究进展
• 本研究前期工作基础
• 存在的主要问题
• 本研究的内容和目的意义
• 第一章 S1、M、N、IL-2、IL-18目的基因鉴定及双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red的构建、鉴定
• 摘要
• 1.引言
• 2.材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒、宿主菌和细胞株
• 2.1.2 工具酶及试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 IL-2、IL-18基因的扩增及测序鉴定
• 2.2.2 IBV S1、M、N结构基因的测序鉴定
• 2.2.3 中间质粒pcEGFP的构建
• 2.2.4 中间质粒pEGFP-IRES的构建
• 2.2.5 双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red的构建
• 2.2.6 双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red的表达检测
• 3.结果
• 3.1 IL-2、IL-18基因的扩增及测序结果
• 3.2 IBV S1、M、N结构基因的测序结果
• 3.3 中间质粒pcEGFP的酶切鉴定
• 3.4 中间质粒pEGFP-IRES的酶切鉴定
• 3.5 双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red的酶切鉴定
• 3.6 双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red表达检测结果
• 4.讨论
• 4.1 S1、M、N、IL-2、IL-18目的基因的测序鉴定
• 4.2 双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red的构建与鉴定
• 5.小结
• 第二章 禽传染性支气管炎病毒结构蛋白基因S1、M、N分别与IL-2/IL-18双顺反子表达质粒的构建及鉴定
• 摘要
• 1.引言
• 2.材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒、宿主菌和细胞株
• 2.1.2 工具酶及试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 中间质粒pIRES-S1/Red、pIRES-M/Red、pIRES-N/Red的构建
• 2.2.2 双顺反子表达质粒pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2的构建
• 2.2.3 双顺反子表达质粒pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18的构建
• 2.2.4 pIRES-S1、pIRES-M、pIRES-N质粒的构建
• 2.2.5 pIRES-IL2、pIRES-IL18质粒和空质粒的构建
• 2.2.6 双顺反子表达质粒pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2、pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18的表达检测
• 3.结果
• 3.1 pIRES-S1/Red、pIRES-M/Red、pIRES-N/Red质粒的酶切鉴定
• 3.2 S1、M、N基因分别与IL-2、IL-18双顺反子质粒的酶切鉴定
• 3.3 pIRES-S1、pIRES-M、pIRES-N质粒的酶切鉴定
• 3.4 pIRES-IL2、pIRES-IL18质粒和空质粒的酶切鉴定
• 3.5 S1、M、N基因分别与IL-2、IL-18双顺反子质粒转录产物的RT-PCR检测结果
• 3.6 S1、M、N基因分别与IL-2、IL-18双顺反子质粒表达产物的间接免疫荧光检测结果
• 4.讨论
• 4.1 结构基因与细胞因子双顺反子表达质粒的构建策略
• 4.2 双顺反子表达质粒转染真核细胞的方法
• 4.3 传染性支气管炎病毒结构蛋白基因的体外表达
• 5.小结
• 第三章 pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2、pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18双顺反子DNA疫苗的配制和免疫原性研究
• 摘要
• 1.引言
• 2.材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物和攻毒用毒株
• 2.1.2 工具酶及试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 质粒的制备与纯化
• 2.2.2 脂质体的制备、转染效率的检测
• 2.2.3 DNA疫苗的配制
• 2.2.4 pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2、pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18双顺反子DNA疫苗的免疫原性研究
• 3.结果
• 3.1 质粒的鉴定
• 3.2 脂质体的电镜观察
• 3.3 脂质体的转染效率检测
• 3.4 pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2、pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18双顺反子DNA疫苗免疫后ELISA抗体效价的检测结果
• 3.5 pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2、pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18双顺反子DNA疫苗免疫后外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的检测结果
• 3.6 攻毒实验结果
• 4.讨论
• 4.1 质粒的制备和DNA疫苗的配制
• 4.2 S1、M、N基因与IL-2/IL-18双顺反子DNA疫苗的免疫效果
• 4.3 双顺反子DNA疫苗与混合DNA疫苗免疫效果的比较
• 4.4 关于攻毒保护率
• 5.小结
• 第四章 pIRES-M/E真核表达质粒的构建及免疫原性研究
• 摘要
• 1.引言
• 2.材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒、细胞株和实验动物
• 2.1.2 工具酶及试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 病毒RNA提取
• 2.2.2 E基因的RT-PCR扩增
• 2.2.3 双顺反子表达质粒pIRES-M/E的构建
• 2.2.4 双顺反子表达质粒pIRES-M/E的表达检测
• 2.2.5 DNA疫苗的制备
• 2.2.6 pIRES-M/E双顺反子DNA疫苗免疫后ELISA抗体效价的检测
• 3.结果
• 3.1 E基因的RT-PCR扩增结果
• 3.2 E基因的测序结果
• 3.3 双顺反子表达质粒pIRES-M/E的酶切鉴定
• 3.4 转录产物的RT-PCR检测结果
• 3.5 pIRES-M/E双顺反子DNA疫苗的制备
• 3.6 pIRES-M/E双顺反子DNA疫苗免疫后ELISA抗体效价的检测结果
• 3.7 pIRES-M/E双顺反子DNA疫苗免疫后外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量的检测结果
• 3.8 攻毒保护
• 4.讨论
• 4.1 M基因和E基因共表达DNA疫苗的免疫原性
• 5.小结
• 第五章 禽传染性支气管炎病毒mRNA3的分子特性研究及其内部核糖体进入功能的检测
• 摘要
• 1.引言
• 2.材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 种毒、宿主菌和质粒
• 2.1.2 分子生物学试剂
• 2.1.3 生化试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 病毒的增殖
• 2.2.2 病毒RNA的提取
• 2.2.3 引物的设计与合成
• 2.2.4 mRNA3（3a3b3c）RT-PCR扩增、克隆及序列分析
• 2.2.5 3a3b二级结构预测
• 2.2.6 重组质粒p3a3b-EGFP/Red的构建及鉴定
• 2.2.7 p3a3b-EGFP/Red与pIRES-EGFP/Red比较,分析3a3b内部核糖体进入位点的功能
• 3.结果
• 3.1 mRNA3（3a3b3c）RT-PCR扩增、克隆测序、序列分析结果
• 3.2 3a3b二级结构预测结果
• 3.3 重组质粒p3a3b-EGFP/Red的鉴定结果
• 3.4 p3a3b-EGFP/Red与pIRES-EGFP/Red的比较及3a3b内部核糖体进入位点的分析结果
• 4.讨论
• 4.1 本研究所用毒株的mRNA3（3a3b3c）分子与国内外的比较及特点
• 4.2 3a3b编码区二级结构预测结果
• 4.3 3a3b与IRES序列的功能比较
• 5.小结
• 结论
• 文献综述
• 1.禽传染性支气管病毒的概述
• 2.禽传染性支气管炎基因工程疫苗研究进展
• 3.细胞因子作为基因佐剂的研究进展
• 4.双顺反子表达质粒的国内外研究进展
• 5.禽传染性支气管炎病毒分子生物学及mRNA3分子特性研究进展
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 在读博士期间发表的论文情况