论文摘要
研究目的:1.研制抗人FXYD3单克隆抗体并对其进行生物学鉴定;2.探讨FXYD3在肝胆系统肿瘤中的组织学分布及与肿瘤组织的生物学行为关系,揭示FXYD3蛋白在肿瘤演变过程中与其可能存在的内在联系;3.从蓖麻籽中提取蓖麻毒素并对其进行生化鉴定;4.比较肝胆肿瘤细胞系对蓖麻毒素毒性作用的敏感性及该毒素对FXYD3表达水平的影响,为本系列后期研究蓖麻毒素与抗人FXYD3单克隆抗体相连的免疫毒素及其在体内作用的实验研究提供依据研究方法:1.采用BioSunV1.0分析软件分析FXYD3抗原抗体结合特性的优势抗原表位,采用固相合成法合成多肽并与载体蛋白KLH偶联后免疫BALB/c小鼠,利用Kohler与Milstein于1975年创建的杂交瘤技术制备抗人FXYD3单克隆抗体,并对其进行特性分析:间接ELISA方法测定抗体的相对亲和常数,Western-Blot法检测抗体的特异性,通过免疫细胞化学检测FXYD3在胰腺癌BxPc-3细胞系中的表达,并观察FXYD3蛋白在细胞中的定位;2.用制备好的FXYD3单克隆抗体检测肿瘤细胞系原发性肝癌HepG2、胆管细胞癌Hcccc-9810、胰腺癌BxPc-3及肿瘤组织中的表达。免疫组化和免疫细胞化学及Western-Blot法定性判断FXYD3蛋白是否表达,Real-time PCR法定量判断FXYD3蛋白的表达程度;3.将传统的由Nicolson与Blaustein创建的提取方法稍加改进,从蓖麻种子中提取天然蓖麻毒素并利用Sepharose 4B亲和层析法进行纯化,SDS-PAGE电泳进行鉴定;4.以肿瘤细胞系原发性肝癌HepG2、、胆管细胞癌Hcccc-9810、胰腺癌BxPc-3为研究对象,MTT比色法分析蓖麻毒素对不同肿瘤细胞的抑制作用,流式细胞分析法分析其对Hcccc-9810细胞周期的影响及蓖麻毒素与肿瘤细胞系共培养研究该毒素对FXYD3在不同细胞中表达的影响。研究结果:1.获得了4株稳定分泌抗人FXYD3的杂交瘤细胞株,其中76-02F1E8特异性最显著,效价可达1∶105,亲和常数为3.11×108L/mol。所有分泌的抗体亚型均为IgG1型,轻链为κ链;2.原发性肝癌、胆管癌、胃癌、乳腺癌均有FXYD3蛋白的表达,且前两者与相应的癌旁组织相比,表达有统计学差异（P＜0.05）;胆管癌组织FXYD3的表达与肿瘤细胞的分化程度相关。胰腺癌BxPc-3、胆管细胞癌Hcccc-9810与原发性肝癌HepG2均阳性表达FXYD3,且表达程度依次降低。3.从500g蓖麻籽中提取到10.25mg蓖麻毒素,浓度为1.3mg/ml;4.蓖麻毒素对肝癌细胞、胰腺癌细胞和胆管癌细胞的抑制作用在不同浓度下(1×10-11mol/L、1×10-10mol/L、1×10-9mol/L、1×10-8mol/L和1×10-7mol/L)无差异性,IC50分别为0.637×10-9mol/L、0.366×10-9mol/L和0.535×10-9mol/L;该毒素可使Hcccc-9810细胞周期停滞在G0/G1期从而促进细胞凋亡;不同浓度蓖麻毒素的作用下,BxPc-3和Hcccc-9810细胞表达FXYD3的水平均有不同程度的降低。研究结论:1.FXYD3蛋白可能与原发性肝癌、胆管癌、胃癌、乳腺癌及胰腺癌等肿瘤的发生发展有一定关系2.FXYD3的表达有可能成为胆管癌预后的一个重要辅助指标;3.FXYD3分别与AFP、CA19-9联合检测有可能提高原发性肝癌和胆管癌的检出率;4.HepG2、BxPc-3和Hcccc-9810对蓖麻毒素抑制作用均较为敏感且无选择性;5.蓖麻毒素可导致FXYD3在肿瘤细胞中表达减少。