猪繁殖与呼吸综合征重组假型杆状病毒基因工程疫苗研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病。PRRS自1987年首次报道发现于美国以来,现已遍及世界各主要养猪国家与地区,并已成为危害养猪业最严重的传染病之一。同其它病毒性疾病的防制一样,免疫接种仍是预防与控制PRRS的主要措施。目前用于预防PRRS的主要商用疫苗是传统的常规弱毒疫苗和灭活疫苗,但由于存在弱毒疫苗散毒和灭活疫苗免疫效果不理想等原因,使得这两种疫苗的使用都存在着一定的争议。因此,研制更安全、高效、廉价的新型疫苗成为研究者关注的焦点。ORF5基因编码的囊膜糖蛋白GP5是PRRSV的主要免疫原性蛋白,也是目前研制PRRSV新型疫苗的主要靶蛋白。但单独基于天然ORF5基因构建的一些试验性疫苗普遍存在诱发中和抗体缓慢和不高的问题。最近研究证实将通用型辅助性T淋巴细胞表位（PADRE）插入ORF5基因的中和表位和覆盖表位间,获得修饰后的ORF5基因ORF5m,可以使ORF5基因的中和表位充分暴露,从而诱发更强的免疫反应。另外,GP5蛋白与ORF6基因编码的M蛋白在成熟的病毒粒子和感染的细胞内可以形成异源二聚体GP5/M,并且这种异源二聚体的形成能促进GP5蛋白的翻译后修饰、转运,从而促进免疫动物产生更强的特异性免疫应答。杆状病毒载体是目前应用十分广泛的载体之一,主要应用于基因治疗、基因功能研究、疫苗开发等领域。近年来研究发现,这种载体可以携带以哺育动物启动子驱动的外源基因表达盒进入哺乳动物细胞,从而在哺乳动物细胞内使外源基因得到高效稳定的表达,而其自身基因组并不复制和表达。同时,经过适当的修饰或预处理,杆状病毒表达载体还可介导外源基因在哺乳动物体内获得表达。目前利用杆状病毒作为体内基因投送的载体已受到广泛的关注。但研究证实血清补体系统是杆状病毒体内基因转导过程中的主要抑制因素。因此,为了消除杆状病毒的补体敏感性,本研究利用水泡性口炎病毒G蛋白对杆状病毒进行了修饰,构建了囊膜表面展示有水泡性口炎G蛋白的杆状病毒载体。在此基础上将由CMV启动子驱动的PRRSV ORF5m基因和PRRSV ORF6基因两个独立的表达盒以转座的方式重组入杆状病毒基因组中,获得重组杆状病毒BV-G-5m/6。将重组病毒以3种不同剂量（109pfu/只,108pfu/只,107pfu/只）经肌肉注射免疫Balb/c小鼠,同时与共表达PRRSV ORF5m和ORF6基因的常规DNA疫苗pCI-5m6进行比较。结果重组病毒BV-G-5m/6所诱发的免疫反应呈剂量依赖性,但3种不同剂量的重组病毒所诱导的IFN-γ水平和中和抗体水平均明显高于常规DNA疫苗免疫组,其中109pfu重组病毒免疫组所诱导的免疫反应最强,二免后3周平均中和抗体水平达到1:32以上,ELISA检测IFN-γ水平达90pg/ml以上。表明重组杆状病毒BV-G-5m/6是一种具有良好发展前景的猪繁殖与呼吸综合征候选疫苗。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表（Abbreviation）
• 第1章 文献综述
• 1.1 猪繁殖与呼吸综合征
• 1.2 PRRS的危害及流行病学特点
• 1.3 PRRSV病原特性
• 1.3.1 PRRSV的分类
• 1.3.2 PRRSV的理化学特性
• 1.3.3 PRRSV的抗原性
• 1.3.4 PRRSV的致病机理及生物学特性
• 1.4 PRRSV分子生物学研究进展
• 1.4.1 PRRSV基因组的结构与功能
• 1.4.2 PRRSV的蛋白质
• 1.4.3 PRRSV的基因组变异和RNA重组
• 1.4.4 PRRSV的抗原性变异
• 1.4.5 PRRSV的毒力变异
• 1.5 PRRSV的免疫学反应
• 1.5.1 抗PRRSV的体液免疫反应
• 1.5.2 抗PRRSV的细胞免疫反应
• 1.5.3 PRRSV与免疫抑制
• 1.6 PRRS疫苗研究进展
• 1.6.1 PRRS传统常规疫苗
• 1.6.2 PRRS新型疫苗研究进展
• 1.7 杆状病毒简介
• 1.7.1 杆状病毒表达系统的研究
• 1.7.1.1 杆状病毒表达系统安全性高
• 1.7.1.2 昆虫杆状病毒表达系统目的基因容量大
• 1.7.1.3 杆状病毒表达系统蛋白表达效率高
• 1.7.1.4 杆状病毒表达系统具有翻译后修饰系统
• 1.7.1.5 杆状病毒表达系统操作简单
• 1.7.2 杆状病毒作为哺乳动物细胞表达载体的研究
• 1.7.3 杆状病毒作为哺乳动物细胞表达载体在疫苗研究中的应用
• 第2章 研究目的与意义
• 第3章 材料与方法
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 毒株、细胞与菌株
• 3.1.2 载体与质粒
• 3.1.3 工具酶及主要试剂
• 3.1.4 培养基与抗生素及其配制
• 3.1.5 免疫反应试验所用抗原及血清
• 3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制
• 3.1.7 实验动物
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 限制性内切酶酶切反应
• 3.2.2 PCR产物或酶切产物的电泳检测
• 3.2.3 线性质粒DNA末端去磷酸化
• 3.2.4 PCR产物或酶切产物回收与纯化
• 3.2.5 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
• 3.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 3.2.7 连接产物的转化
• 3.2.8 质粒的制备与鉴定
• 3.2.9 质粒转染（脂质体介导转染法）
• 3.2.10 构建重组杆状病毒的操作流程及示意图
• 3.2.11 重组穿梭载体（Bacmid）的构建
• 3.2.12 重组穿梭载体（Bacmid）的提取
• 3.2.13 重组杆状病毒获得
• 3.2.14 重组杆状病毒转导Maco-145细胞
• 3.2.15 间接免疫荧光试验（IFA）检测目的蛋白的体外表达
• 3.2.16 微量中和试验（固定病毒-稀释血清法）
• 3.2.17 细胞免疫的检测
• 3.2.18 动物试验
• 3.2.19 统计学方法
• 第4章 结果与分析
• 4.1 穿梭质粒Bacmid-G-5m/6的构建
• 4.1.1 pFastBac-G质粒的构建
• 4.1.2 pFastBac-G-5m/6转移质粒的构建
• 4.1.3 重组Bacmid-G-5m/6的构建
• 4.2 重组杆状病毒BV-G-5m/6获得
• 4.3 间接免疫荧光检测PRRSV ORF6和修饰的ORF5基因的表达
• 4.4 重组杆状病毒毒价测定
• 4.5 重组杆状病毒BV-G-5m/6在小鼠体内的免疫效力检验
• 4.5.1 特异性抗猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体检测
• 4.5.2 ELISA方法分析免疫小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ水平
• 4.5.3 荧光定量PCR方法分析免疫小鼠脾淋巴细胞IFN-γ的mRNA水平
• 第5章 讨论与结论
• 5.1 讨论
• 5.1.1 VSV-G修饰的重组杆状病毒的构建
• 5.1.2 杆状病毒转导哺乳动物细胞可能机制
• 5.1.3 重组杆状病毒诱导的免疫应答
• 5.1.4 杆状病毒的佐剂效应
• 5.2 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录