基因重组毕赤酵母表达阿片肽对小鼠免疫作用及其机制研究

论文题目: 基因重组毕赤酵母表达阿片肽对小鼠免疫作用及其机制研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 粮食,油脂与植物蛋白工程

作者: 韩飞

导师: 乐国伟,施用晖

关键词: 毕赤酵母,阿片肽,分离纯化,免疫调节,基因表达,机制

文献来源: 江南大学

发表年度: 2005

论文摘要: 阿片肽是一类生物活性多肽,在神经内分泌与免疫调节中起重要的调节作用,具有镇痛,镇静,调节免疫,促进摄食,调节睡眠,缓解压力和紧张,抑制胃肠道运动和消化液分泌,影响生殖和泌乳,调节心血管系统功能等生理活性,其在医药和动物生产中有着广阔的应用前景。本研究从基因重组阿片肽发酵表达条件的优化开始,使用新的阿片肽定量研究方法,进行了基因重组阿片肽的分离纯化工作,并结合国内外研究现状,着重研究了分离纯化得到的3种阿片肽对小鼠非特异性免疫,细胞免疫和体液免疫各项指标的影响;利用RT-PCR方法,从基因转录水平,研究了体内两种给药方式下3种阿片肽对小鼠体内不同脏器组织的μ阿片受体,δ阿片受体以及肽转运载体PepT1 mRNA丰度变化情况;初步研究了阿片肽对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的免疫调节作用。1.利用基因重组毕赤酵母发酵表达阿片肽对基因重组毕赤酵母的表达条件进行了优化。结果表明,毕赤酵母对外源阿片肽表达的最优摇瓶发酵条件为:培养基BMMY(pH5.6),甲醇诱导浓度0.75%,菌体起始浓度40 OD600,摇床设定温度28℃,转速250转/分钟。按以上条件进行表达,N-Tyr肽含量达到了201.1mg/L。2.阿片肽的提取分离和活性鉴定建立了一套基因重组阿片肽的分离纯化方法。将基因重组毕赤酵母经适宜的生长和表达培养后,所得的发酵液经离心得无细胞上清液,上清液超滤后过Sephadex G-10柱,将所得具有阿片活性的粗品用HPLC-MS分析,依据分子量确定活性组分中可能存在的阿片肽,然后根据这些阿片肽的等电点和疏水性,利用?KTA Purifier 100快速纯化系统的DEAE-阴离子交换柱和Sephasil peptide C18反相高压液相柱分离得到六种阿片肽,鉴定纯度后测定其氨基酸组成。六种阿片肽分别为YGGFM、YGGFMT、YPFPGPI、YPFPGPIR、YPFPGPIRYG和YGGFMTSEK,其中YGGFMT、YPFPGPIR、YPFPGPIRYG和YGGFMTSEK目前尚未见报道。3.不同类型阿片肽对小鼠免疫细胞的免疫作用从分离纯化出的六种阿片肽中选出OP1(YPFPGPI,β-CM-7)、OP2(YPFPGPIRYG)和OP3(YGGFM,M-Enk)三种阿片肽进行后续的研究工作。利用体外细胞培养法研究三种阿片肽对小鼠的免疫作用。研究发现,三种阿片肽对体外培养小鼠的免疫细胞呈双向调节作用。阿片肽的浓度一般在10-7mol/L时,刺激或抑制作用表现最强。且体外培养实验表明,OP1对胸腺和脾细胞的作用是通过胸腺和脾细胞上的经典阿片受体和非经典阿片受体(能够被阿片受体拮抗剂纳酪酮逆转的为经典阿片受体,反之为非经典阿片受体)共同完成的;OP2和OP3对胸腺和脾细胞的作用是完全通过胸腺和脾细胞上的经典阿片受体完成的。4.体内法研究不同类型阿片肽对小鼠的免疫作用采用腹腔注射和饮水中添加阿片肽的方法研究阿片肽对小鼠的免疫调节作用。研究

论文目录:

中文摘要

ABSTRACT

第一章 绪论

1.1 阿片肽概论

1.1.1 阿片肽概述

1.1.2 阿片肽的生理功能

1.2 阿片肽对免疫系统的作用及其机制研究进展

1.2.1 神经、免疫和内分泌系统间的关系

1.2.2 阿片肽对免疫系统的调节作用及其机制

1.2.3 阿片受体研究进展

1.3 阿片肽的来源

1.3.1 毕赤酵母表达系统的优势

1.3.2 基因工程毕赤酵母的一般发酵过程

1.3.3 影响毕赤酵母表达外源蛋白的因素

1.4 本文的主要研究内容

1.5 参考文献

第二章 利用基因重组毕赤酵母发酵表达阿片肽

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验材料

2.2.2 主要仪器

2.2.3 培养方法

2.2.4 分析方法

2.3 实验结果与讨论

2.3.1 目的阿片肽含量测定

2.3.2 生长阶段的摇瓶发酵条件

2.3.3 甲醇最佳添加时间的确定

2.3.4 诱导表达最优时间的确定

2.3.5 工程菌表达条件的正交优化

2.4 本章小结

2.5 参考文献

第三章 阿片肽的提取分离和活性鉴定

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 实验材料

3.2.2 主要仪器

3.2.3 实验方法

3.3 结果和讨论

3.3.1 阿片肽活性测定

3.3.2 阿片肽的分离纯化

3.4 本章小结

3.5 参考文献

第四章 不同类型阿片肽对小鼠免疫细胞的免疫作用

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 实验材料

4.2.2 主要仪器

4.2.3 实验方法

4.2.4 统计分析

4.3 实验结果

4.4 讨论

4.5 本章小结

4.6 参考文献

第五章 体内法研究不同类型阿片肽对小鼠的免疫作用

5.1 前言

5.2 材料和方法

5.2.1 实验一:利用腹腔注射研究不同类型阿片肽对小鼠的免疫作用

5.2.2 实验二:利用饮水处理研究不同类型阿片肽对小鼠的免疫作用

5.2.3 统计分析

5.3 实验结果

5.3.1 腹腔注射不同类型阿片肽对小鼠免疫系统的作用结果

5.3.2 饮水中添加不同类型阿片肽对小鼠免疫系统的影响

5.4 讨论

5.5 本章小结

5.6 参考文献

第六章 阿片肽对环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠免疫调节作用的初步研究

6.1 前言

6.2 材料和方法

6.2.1 实验材料

6.2.2 主要仪器

6.2.3 阿片肽对Cy 免疫抑制小鼠胸腺T 细胞和脾脏T,B 淋巴细胞体外增殖的影响

6.2.4 腹腔注射阿片肽对Cy 诱导免疫抑制小鼠拮抗作用的研究

6.2.5 统计分析

6.3 结果和分析

6.3.1 阿片肽对Cy 免疫抑制小鼠胸腺T 细胞和脾脏TB,淋巴细胞体外增殖的影响

6.3.2 腹腔注射阿片肽对Cy 诱导免疫抑制小鼠拮抗作用的研究

6.4 讨论

6.5 本章小结

6.6 参考文献

第七章 阿片肽对小鼠组织阿片受体和肽转运载体基因表达的影响

7.1 前言

7.2 材料和方法

7.2.1 实验一利用腹腔注射研究阿片肽对小鼠不同组织阿片受体基因表达的影响

7.2.2 实验二饮水中添加阿片肽对小鼠组织阿片受体和肠道肽转运载体基因表达的影响

7.2.3 统计分析

7.3 实验结果

7.3.1 腹腔注射阿片肽对小鼠胸腺、脾脏和脑组织中μ阿片受体和δ阿片受体mRNA 表达的影响

7.3.2 饮水中添加阿片肽对小鼠胸腺、脾脏、脑组织和小肠中μ阿片受体、δ阿片受体以及肽转运载体PepT1 mRNA 表达的影响

7.4 讨论

7.5 本章小结

7.6 参考文献

论文的主要结论和创新点

致谢

博士研究生期间发表(录用)与论文有关的学术论文

发布时间: 2006-07-20

参考文献

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