多杀菌素产生菌的基因组重排育种

论文摘要

多杀菌素（spinosyn）是由刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）经有氧发酵产生的一类新型大环内酯类化合物。它是一种低毒、低残留、对昆虫天敌安全、作用机理独特的天然杀虫剂。本试验通过建立刺糖多孢菌原生质体制备再生最佳条件,运用抗性耐受突变及基因组重排技术,开展了刺糖多孢菌高产多杀菌素的菌株选育工作。试验结果显示S.spinosa原生质体制备的最佳条件为250mL三角瓶（带有不锈钢弹簧）装50ml含10%蔗糖的TSB培养基、孢子悬液接种,28℃,200r/min培养48h;3000r/min收集菌丝体并用0.3mol/L蔗糖清洗一次;用含3mg/mL溶菌酶P缓冲液悬浮菌丝体,32℃下处理100min;M-G培养是最合适的原生质体再生培养基;原生质体可在—70℃保存。以刺糖多孢菌N229-17（多杀菌素产量334μg/mL）和C131-24（多杀菌素产量279μg/mL）为出发菌株,进行原生质体亚硝酸和微波诱变,筛选Str+和Gen+抗性菌株,结果显示菌株的抗性水平与多杀菌素产量呈正相关,并得到了菌株Y23（Str+Gen-）和W16（Str-Gen+）。通过Y23和W16进行原生质体融合研究试验,结果显示40%的PEG1000对原生质体融合有很好的促进作用。以Y23、W16、P131、U108-41和N613为亲本菌株进行基因组重排研究,结果显示随着重排深入,高产菌株出现频率增加。通过3轮Genome shuffling处理,筛选获得菌株F113（528μg/mL）,发酵效价较原始菌株N229-17提高了58.1%,传代试验表明菌株稳定性好。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 多杀菌素的历史
• 1.2 多杀菌素的产生菌
• 1.3 多杀菌素的化学结构
• 1.4 多杀菌素的理化性质
• 1.5 多杀菌素的生物活性
• 1.5.1 多杀菌素的作用机理
• 1.5.2 多杀菌素的活性谱
• 1.5.3 多杀菌素的毒性
• 1.6 多杀菌素的生物合成
• 1.6.1 多杀菌素的生物合成基因
• 1.6.2 多杀菌素的生物合成途径
• 1.7 多杀菌素的育种
• 1.7.1 常规育种
• 1.7.1.1 经典诱变育种
• 1.7.1.2 原生质体育种
• 1.7.1.3 定向筛选育种
• 1.7.2 分子育种
• 1.8 基因组重排育种
• 1.8.1 基因组重排简介
• 1.8.2 基因组重排方法
• 1.8.3 基因组重排应用
• 1.9 目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.2.1 斜面培养基
• 2.1.2.2 种子培养基
• 2.1.2.3 发酵培养基
• 2.1.2.4 原生质体制备培养基
• 2.1.2.5 原生质体再生培养基
• 2.1.3 培养条件
• 2.1.3.1 斜面菌种培养条件
• 2.1.3.2 种子培养条件
• 2.1.3.3 发酵培养条件
• 2.1.3.4 原生质体制备培养条件
• 2.1.3.5 原生质体再生培养条件
• 2.1.4 主要试剂和仪器
• 2.1.4.1 试验中所用到的主要药品和试剂
• 2.1.4.2 试验中所用到的主要试验仪器
• 2.1.5 重要溶液和缓冲液
• 2.1.5.1 微量元素液
• 2.1.5.2 P缓冲液
• 2.1.5.3 溶菌酶溶液
• 2.1.5.4 Tris-HCL缓冲液
• 2.1.5.5 结晶紫染液
• 2.2 方法
• 2.2.1 分析方法
• 2.2.1.1 初筛（TLC法）
• 2.2.1.2 复筛（HPLC法）
• 2.2.1.3 菌丝体干重（DCW）的测定
• 2.2.1.4 pH值的测定
• 2.2.1.5 正突变率的计算
• 2.2.1.6 致死率的计算
• 2.2.2 诱变处理方法
• 2.2.2.1 微波诱变
• 2.2.2.2 亚硝酸诱变
• 2.2.3 菌落形态不同与产素关系分析
• 2.2.4 原生质体的制备、计数、再生和融合
• 2.2.4.1 制备方法
• 2.2.4.2 原生质体的计数方法
• 2.2.4.3 原生质体融合的方法
• 2.2.4.4 融合率的计算
• 2.2.5 基因组重排（Genome shuffling）的方法
• 2.2.5.1 第1轮原生质体融合
• 2.2.5.2 杂合再生子代菌丝体的培养
• 2.2.5.3 杂合子代的原生质体制备和融合
• 3 结果与分析
• 3.1 原生质体制备
• 3.1.1 菌龄对原生质体制备的影响
• 3.1.2 菌丝体培养方式对原生质体制备的影响
• 3.1.3 菌丝体培养基组分对原生质体制备的影响
• 3.1.3.1 甘氨酸浓度对原生质体制备的影响
• 3.1.3.2 培养基中蔗糖浓度对原生质体制备的影响
• 3.1.4 溶菌酶浓度对原生质体制备的影响
• 3.1.5 酶解时间对原生质体制备的影响
• 3.1.6 酶解温度对原生质体制备的影响
• 3.2 原生质体再生
• 3.2.1 P缓冲液中缓冲剂对原生质体再生率的影响
• 3.2.2 再生培养基组分对原生质体再生率的影响
• 3.2.3 —70℃对原生质体存活率的影响
• 3.3 原生质体融合
• 3.3.1 40%PEG分子量对融合率的影响
• 3.3.2 不同浓度PEG1000对融合率的影响
• 3.4 原生质体诱变
• 2）诱变处理'>3.4.1 亚硝酸（HNO₂）诱变处理
• 3.4.2 微波诱变处理
• 3.5 菌株抗性与产素的相互关系
• 3.5.1 链霉素（Streptomycin）抗性菌株选育
• 3.5.2 庆大霉素（Gentamicin）抗性菌株选育
• 3.5.3 抗性菌株的遗传稳定性
• 3.6 菌落形态不同与产素关系分析
• 3.7 基因组重排育种
• 3.7.1 出发菌株的选择
• 3.7.2 菌株效价与融合轮数的关系
• 3.7.3 重组高产菌株的选育
• 3.7.4 重排高产菌株的稳定性
• 3.8 诱变和筛选流程图
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢