海参cDNA文库的构建和序列分析以及组织蛋白酶L基因的克隆

论文摘要

应用Gubler-Hoffman cDNA Library Construction技术，构建仿刺参cDNA文库。测试结果表明，库容量为2.0106pfu/ml，利用PCR方法检测cDNA文库插入DNA片段的大小，其长度范围在0.5-4.1kb，插入片段平均长度为1.3kb，表明该文库达到建库要求，可用来筛选低丰度mRNA的基因克隆。随机挑选100个1kb以上的cDNA克隆进行测序分析，发现有26条EST序列和网上公布其它物种的序列相似性较高，这些基因与刺参能量代谢和蛋白水解相关。其中发现的几个重要基因，如编码遍在蛋白以及缬酪肽蛋白和组织酶L相关蛋白等，可能与仿刺参自溶过程的蛋白酶水解和细胞凋亡事件相关。另有74条EST序列相似性较低，推测可能是功能未知的新基因。组织蛋白酶L是一种嗜酸性溶酶体蛋白水解酶，广泛存在于人体各种正常组织细胞和肿瘤细胞中，它不仅参与生物体内各种蛋白水解，还参与许多重要的生命活动，如抗原呈递、肿瘤入侵和转移、骨质吸收、细胞凋亡等。研究表明，组织蛋白酶L和组织蛋白酶L相关蛋白是同一蛋白的不同亚基，组织蛋白酶L相关蛋白和组织蛋白酶L以对接形式存在，组织蛋白酶L相关蛋白对组织蛋白酶L的靶向作用和表达及其活性起着重要的作用。通过对刺参cDNA文库的部分筛选和序列分析，我们发现了一条组织蛋白酶L相关蛋白基因（GenBank：EU306878）。全长cDNA为1335bp,5’非编码区（UTR）91bp，3’UTR489b，开放阅读框长度756bp，编码251个氨基酸。为此我们提取刺参总RNA，通过RT-PCR和RACE PCR技术，从刺参（Stichopus japonicus）体壁中克隆得到全长的组织蛋白酶L基因（GenBank：EU143709）。其中全长cDNA1129bp，5’非编码区（UTR）202bp，3’UTR87bp，开放阅读框999bp，编码332个氨基酸（aa），包括成熟肽316aa和信号肽16aa。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 刺参简介和功效
• 1.2 基因文库
• 1.2.1 构建基因文库的方法和进展
• 1.2.2 cDNA 文库的应用
• 1.2.3 cDNA 文库技术的局限性
• 1.3 EST 技术及其应用
• 1.4 组织蛋白酶
• 1.4.1 组织蛋白酶简介
• 1.4.2 组织蛋白酶结构
• 1.4.3 组织蛋白酶的功能
• 1.4.4 组织蛋白酶 L
• 1.4.5 组织蛋白酶 L 相关蛋白
• 1.5 研究意义
• 1.6 本文采用的技术路线如下
• 1.7 研究手段
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验原料
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 实验主要试剂
• 2.1.4 生物信息学分析的主要软件与数据库
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 文库构建以及文库筛选和序列分析
• 2.2.2 CL 基因的分离
• 第三章 实验结果和讨论
• 3.1 仿刺参 cDNA 文库构建、EST 序列分析
• 3.1.1 仿刺参总 RNA 提取
• 3.1.2 mRNA 的提取
• 3.1.3 cDNA 文库质量检测
• 3.1.4 仿刺参 cDNA 的序列测定和分析
• 3.2 组织蛋白酶 L 基因的筛选分析
• 3.2.1 CL 基因片段的分离
• 3.2.2 3'RACE 末端扩增
• 3.2.3 5'RACE 末端扩增
• 3.3 CLAP 和 CL 基因的生物信息学分析
• 3.3.1 刺参 CLAP cDNA 全长序列的特征分析
• 3.3.2 刺参 CL cDNA 全长序列的特征分析
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢