禽呼肠孤病毒M1、M2基因克隆序列分析与病毒受体的确定及荧光定量RT-PCR检测方法的建立

论文摘要

禽呼肠孤病毒（ARV）主要感染鸡和火鸡,在鸡群中普遍存在,常与其他疾病混合感染,临床上表现多种病症,导致鸡的生长能力下降及死亡率升高。为了更有效的预防和控制ARV,降低ARV对养禽业的危害,本课题开展了ARV M1、M2基因的克隆与序列分析及病毒受体的初步研究,并应用SYBR GreenⅠ染料建立了ARV的荧光定量RT-PCR检测方法。根据GenBank ARV M1、M2基因序列,设计两对引物,分别对9株ARV的M1、M2基因进行了RT-PCR扩增、克隆及序列测定。结果显示,所构建的克隆质粒中含相应的M1、M2蛋白基因完整ORF,大小分别为2199bp和2031bp,分别编码732和676个氨基酸的μA和μB蛋白;经分析,测序的9株ARV M1、M2基因核苷酸及其推导的氨基酸序列具有高度的同源性,M1基因在99.3%～99.7%和99.3%～99.7%之间,M2基因在98.7%～99.9%和97.8%～99.9%之间。与GenBank上其他呼肠孤病毒株包括美国分离株（2408）、日本分离株（OS161）和4株台湾分离株（1017-1、601G、750505、916SI）进行比较,结果表明所有毒株M1基因的核苷酸和氨基酸同源性都较高,分别在88.3%～100%和97.0%～100%之间;M2基因与2408株和1017-1株的核苷酸和氨基酸同源性高,均在98%以上,而与其他分离株的核苷酸和氨基酸同源性较低,仅在69.5%～72.0%之间和85.5%～89.5%之间;遗传进化树分析表明M2基因中多数台湾株和日本株变异大。将培养的鸡胚成纤维细胞接种ARV S1133病毒株以增殖病毒,待细胞病变达60%-80%时收毒,冻融三次后通过差速离心和蔗糖密度梯度离心纯化病毒,经紫外分光法测病毒蛋白浓度为6.25mg/mL。提纯鸡胚原代肝细胞膜蛋白测浓度为16mg/mL。取24uL浓度为16ug/uL的膜蛋白经SDS-PAGE电泳后,采用病毒铺覆蛋白印迹技术（VOPBA）即膜蛋白电泳后转移到硝酸纤维素膜上依次与病毒、抗血清和酶标二抗作用显出病毒受体结合带的方法结合Bandscan分析病毒受体分子量为68.6kDa。根据S1基因σC结构蛋白基因保守区域设计一对扩增片断为147bp的特异性引物,将PCR扩增的σC基因片段,连接pGM-T载体,重组质粒经筛选、PCR鉴定及测序进一步证实,表明σC片段正确克隆入pGM-T载体中,命名为pGM-T-σC。提取质粒用SalⅠ单酶切得到线性化转录模板DNA,体外转录出RNA,以体外转录的RNA为标准品制定标准曲线,应用SYBR GreenⅠ染料建立了检测禽呼肠孤病毒的一步法荧光定量RT-PCR方法。结果表明,制作的标准曲线定量浓度范围宽,在5.2×102-5.2×109拷贝/uL之间呈良好的线性关系,可检测到每个反应相当于5.2×102个拷贝的标准品RNA;该方法特异性好,与NDV、IBDV、MG都不反应。本课题开展了ARV M1、M2基因的克隆与序列分析及用VOPBA鉴定了ARV受体的分子量,为进一步研究病毒各蛋白间的相互作用、病毒与宿主的相互关系及基因组与致病性的关系提供重要参考。应用SYBR GreenⅠ染料成功建立了检测ARV的一步法实时荧光定量RT-PCR方法,为ARV的流行病学、致病机理研究及快速诊断与防治等方面提供了重要的技术支撑。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 前言
• 第一章 文献综述
• 第一节 禽呼肠孤病毒的研究进展
• 1 概况
• 2 病原特征
• 3 基因组和蛋白
• 4 诊断
• 5 问题与展望
• 第二节 病毒受体的研究进展
• 1 病毒受体概念
• 2 受体特征
• 3 病毒受体研究意义
• 4 确定病毒受体的研究方法
• 5 ARV受体研究展望与存在问题
• 第三节 荧光定量PCR研究进展
• 1 荧光定量PCR定量原理
• 2 荧光PCR的分类
• 3 荧光PCR仪
• 4 荧光定量PCR技术的应用
• 第二章 禽呼肠孤病毒M1、M2基因的克隆与序列分析
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 ARV M1、M2基因的RT-PCR扩增
• 2.2 ARV M1、M2基因的克隆及鉴定
• 2.3 测序结果
• 2.4 M1、M2基因核苷酸序列和氨基酸比较分析
• 2.5 M1、M2基因核苷酸遗传进化树分析
• 3.小结与讨论
• 第三章 禽呼肠孤病毒受体的确定
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 2.1 病毒增殖与纯化
• 2.2 病毒蛋白浓度的测定
• 2.3 鸡胚肝细胞膜蛋白的提取及浓度测定
• 2.4 膜蛋白电泳、转印及ARV受体分子量
• 3 小结与讨论
• 第四章 禽呼肠孤病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 体外转录RNA标准品的制备
• 2.2 荧光RT-PCR方法的建立及优化
• 2.3 特异性试验结果
• 2.4 敏感性比较
• 2.5 组内重复性结果
• 2.6 稳定性试验结果
• 2.7 人工感染鸡病毒的检测
• 3 小结与讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 攻读硕士学位期间所发表的学术论文