论文摘要
背景:植入电子起搏器已成为治疗症状性缓慢性心律失常的首选方法,并取得很大的成功。然而,有限的电池寿命、缺乏对神经激素自动反应性、儿童期植入起搏器后电极不能随身体的发育而相应变长等缺点使得人们迫切需要一种更理想的治疗方法。国内外的学者研究认为利用基因治疗和细胞治疗构建生物起搏在不久的将来可能会成为电子起搏器最为理想的替代方法。然而目前有关生物起搏的体内实验都没有超过2周,这是否与目前研究者所选用的基因以及基因载体有关?慢病毒表达系统因其基因组可以整合于宿主基因组中,长时间、稳定表达外源基因并具有较低的免疫原性,受到广泛关注。所以本实验我们使用5-aza（5-氮胞苷）诱导骨髓干细胞向心肌样细胞转化,同时将HCN4（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated,超极化激活环核苷酸门控）起搏基因使用慢病毒转染进心肌样骨髓基质干细胞,观察在体外能否构建生物起搏细胞,并能长期表达,从而为进一步在体研究生物起搏打下基础。第一部分猪骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离、培养及5-aza诱导其转化为心肌样细胞的研究第一节猪骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离、培养目的:建立猪骨髓间充质干细胞体外培养方法,为5-aza诱导转化为心肌样细胞提供材料。方法:猪的骨髓MSCs分离纯化后,流式细胞仪检测细胞周期。结果:体外培养的原代MSCs 10～14d达到融合,细胞周期显示73%的细胞处于G0/G1期。结论:根据黏附特性分离的猪骨髓MSCs在体外条件下可生长扩增,可用于5-aza诱导转化为心肌样细胞。第二节5-aza体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的研究目的:建立猪骨髓间充质干细胞体外转化为心肌样细胞的方法,为构建生物起搏细胞提供新材料。方法:猪的骨髓MSCs分离纯化后,用5-aza诱导后,用抗结蛋白（desmin）、肌球蛋白重链（MHC）、心肌特异性肌钙蛋白I（cTnI）、连接蛋白-43（Cx-43）进行免疫细胞化学染色鉴定。结果:体外培养的第二代MSCs经5-aza诱导后,部分MSCs呈梭形,阳性表达desmin、MHC、cTnI和Cx-43。结论:根据黏附特性分离的猪骨髓MSCs在体外条件下可分化为心肌样细胞,可用于构建生物起搏细胞。第二部分穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN4的构建及HCN4重组慢病毒的包装第一节穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN4的构建目的:将全长约3.6kb的hHCN4目的基因片段从Dr Stieber教授惠赠的pCDNA3-hHCN4质粒卸载下来,最终装载到带有GFP绿色荧光蛋白标记的去内毒素穿梭质粒pCDH1-MCS1-EF1-copGFP上。方法:用Eco RI和XbaⅠ从pCDNA3-hHCN4质粒切下hHCN4目的片段连接到Puc19载体中,再用EcoRI和HindⅢ从质粒Puc19切下目的片段连接到pcDNA3.1（A）载体中,再用XbaⅠ单酶从质粒pcDNA3.1（A）双切到pCDH1-MCS1-EF1-copGFP中。用XbaⅠ或者Eco RI鉴定,将阳性克隆质粒送上海生工测序,并将构建的目的基因质粒转染293细胞和猪骨髓间充质干细胞。结果:XbaⅠ及Eco RI鉴定表明,PCR的产物和克隆扩增的产物的电泳结果该基因的大小约为3.6kb;阳性克隆质粒测序结果与GENEBANK目的基因HCN4序列完全相同;构建的目的基因质粒转染293细胞和原代的猪骨髓间充质干细胞后,均发现有强烈的绿色荧光的出现。结论:成功将全长hHCN4目的基因片段从pCDNA3-hHCN4质粒卸载下来,装载到去内毒素穿梭质粒pCDH1-MCS1-EF1-copGFP上,可用于下一步慢病毒的包装。第二节HCN4重组慢病毒的包装目的:使用慢病毒包装系统（pPACKH1-Lentivector Packaging Kit）建立稳定的HCN4重组慢病毒。方法:实验过程参照SBI的Lentivector Expression System的操作手册进行。将构建好的慢病毒包装质粒混合物混合后感染293T细胞及心肌样骨髓基质干细胞。结果:构建的慢病毒包装质粒混合物转染293细胞和心肌样猪骨髓间充质干细胞后,均发现有强烈的绿色荧光的出现,细胞感染效率可以达到90%以上。结论:成功建立稳定的hHCN4重组慢病毒,该病毒载体有很高的转染效率。第三部分慢病毒转染基质干细胞构建起搏样细胞的体外研究目的:使用hHCN4重组慢病毒载体转染心肌样骨髓基质干细胞获得稳定过表达HCN4基因的起搏样干细胞。方法:慢病毒转染心肌样骨髓基质干细胞实验过程参照SBI的LentivectorExpression System的操作手册进行;稳定转染细胞继续培养两周后行Western blot鉴定蛋白的表达并行real-time RT-PCR实时荧光定量检测HCN4目的基因的表达情况;全细胞膜片钳记录转染细胞HCN4通道电流的表达;转染细胞体外长期培养观察细胞的转染状态。结果:病毒感染48小时后,目的细胞出现大量的荧光;Western blot检测结果见图,可见一约170kDa条带,与克隆hHCN4通道蛋白分子量相符;RT-PCR显示慢病毒转染的细胞hHCN4-RNA是原代细胞的123倍;膜片钳记录在转染细胞中可记录到明显的电压与时间依赖性的超极化内向电流,即If电流;将转染的心肌样骨髓基质干细胞培养至2个月时,显微镜下发现细胞呈群体性搏动,20℃室温下的搏动频率为15±1次/分。该病毒载体有很高的转染效率,在体外已获得至少8个月的阳性表达,8个月后因为细胞污染未进一步观察。结论:hHCN4重组慢病毒转染心肌样骨髓基质干细胞获得了稳定过表达HCN4基因的起搏样干细胞。这种基因修饰后的心肌样干细胞有可能成为一种有效的生物起搏种子细胞,并期待在缓慢性心律失常的治疗技术上实现新突破。第四部分稳定转染hHCN4起搏通道亚型的电生理特点目的:全细胞膜片钳技术记录稳定转染pCDH1-GFP-HCN4的心肌样骨髓基质干细胞,了解hHCN4起搏通道亚型的电生理特点。方法:全细胞膜片钳技术记录稳定转染pCDH1-GFP-HCN4的心肌样骨髓基质干细胞,观察hHCN4通道电流、通道电流激活曲线及电压依赖性激活时间常数动力学曲线;改变细胞外液K+、Na+浓度,观察K+、Na+对IhHCN4电流的影响;以河豚毒素(TTX,INa阻断剂)、四乙胺（TEA,IK阻断剂）、环磷酸腺苷（cAMP）、异丙基肾上腺素（ISO）、乙酰胆碱（Ach）、铯（Cs+）、ZD7288（If电流特异性阻断剂）和胺碘酮分别灌流,观察它们对IhHCN4电流的影响。结果:1.大多数稳定转染的心肌样骨髓干细胞可记录到约-80mV开始激活的一系列超极化内向离子流(IhHCN4电流,该电流激活缓慢,呈电压、时间依赖性。电流的激活电位(Vth)、半最大激活电位(V1/2)分别为-83±8mV、-108±2mV,斜率为-11.2±0.6 mV（n=10）。钳制电压-140mV时,激活时间常数为0.66±0.1s;钳制电压-110mV时,激活时间常数为3.1±0.7s。IhHCN4的反转电位21.2±2.3mV（n=10）,PNa/PK为0.23。2.钳制电位-140mV,外液K+浓度30 mmol/L,Na+浓度由110 mmol/L降为50mmol/L,IhHCN4电流密度分别为-300±25pA/pF-1、-87±10 pA/pF-1（n=8,p＜0.001）,减少73%;外液Na+浓度110 mmol/L,K+浓度由30 mmol/L降为5 mmol/L,IhHCN4电流密度分别为-302±30pA/pF-1、-244±19 pA/pF-1（n=8,p＜0.05）,减少20%。3.TTX和TEA灌流10min,对IhHCN4没有影响。4.1mmol/L cAMP灌流10min,IhHCN4无明显变化,电极内液中加入终浓度为1mmol/L的cAMP,IhHCN4激活加快,激活时间加快,V1/2由-109±2mV变为-92±2mV,向正向移动17mV（n=10,p＜0.05）,激活阈值及最大激活电流没有明显改变5.1μmol/L ISO灌流10min,IhHCN4略加快。1μmol/L Ach灌流10min,IhHCN4无明显改变。6.低浓度Cs+可阻滞IhHCN4,冲洗后抑制作用完全恢复,半效抑制浓度（IC50）为128.8±28.1μmol/L;较低浓度ZD7288可阻滞IhHCN4,冲洗后抑制作用不能恢复,IC50为23.8±5.7μmol/L。7.胺碘酮可阻滞IhHCN4,冲洗后抑制作用无明显恢复,IC50为1.34±0.33μmol/L;胺碘酮使各钳制电压下IhHCN4激活缓慢。结论:重组HCN4慢病毒转染心肌样干细胞,其表达的IhHCN4电流具有天然If电流特点,表现为电压与时间依赖性的超极化内向电流、cAMP直接激活、Na+/K+离子混合通透,Cs+、ZD7288可以阻断IhHCN4;胺碘酮可以抑制IhHCN4,这些不仅为起搏通道HCN4基因治疗缓慢性心律失常提供理论基础,同时也为胺碘酮治疗由于起搏电流异常增加所致的快速型心律失常提供实验依据。
论文目录
相关论文文献
- [1].HCN4基因在风湿性心脏病二尖瓣狭窄伴心房颤动心房组织中蛋白表达的研究[J]. 广西医科大学学报 2010(03)
- [2].风湿性二尖瓣狭窄心房颤动患者HCN4基因cDNA序列测定及mRNA的表达[J]. 中国胸心血管外科临床杂志 2010(02)
- [3].心律失常中HCN4突变与功能改变和表型的相关研究[J]. 中国分子心脏病学杂志 2019(04)
- [4].微波辐射对大鼠窦房结组织HCN4基因表达的影响[J]. 新乡医学院学报 2014(09)
- [5].以HCN4为靶向的参仙升脉口服液治疗窦性心动过缓机制探究[J]. 中南药学 2017(03)
- [6].构建人HCN4基因重组腺病毒载体及其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率[J]. 中国组织工程研究与临床康复 2009(45)
- [7].心房颤动大鼠心房肌HCN2、HCN4表达及青山健心片的干预作用[J]. 中西医结合心脑血管病杂志 2020(14)
- [8].携带人HCN4与Tbx3基因慢病毒的构建[J]. 临床心血管病杂志 2015(03)
- [9].心源性猝死者窦房结病理学观察和HCN4、Cx45的表达及其意义(英文)[J]. 现代生物医学进展 2009(23)
- [10].膀胱过度活动症大鼠膀胱及脊髓背根节中HCN4离子通道蛋白的表达[J]. 现代泌尿外科杂志 2014(05)
- [11].风心二狭房颤患者心房组织的HCN4基因表达及动作电位的研究[J]. 广西医科大学学报 2012(01)
- [12].风湿性心脏病心房颤动HCN4基因mRNA表达的实验研究[J]. 临床心血管病杂志 2012(11)
- [13].人HCN4基因真核表达质粒构建及在HEK293细胞中的表达[J]. 皖南医学院学报 2016(06)
- [14].Shox2基因转染后犬骨髓间充质干细胞HCN4表达的变化[J]. 第三军医大学学报 2015(09)
- [15].HCN2与HCN4在风湿性心脏病二尖瓣狭窄患者并发心房颤动中的协同表达[J]. 临床心血管病杂志 2014(03)
- [16].人HCN4通道的滞后现象:影响窦房结起搏的潜在决定因素(英文)[J]. 生理学报 2010(01)
- [17].HCN4、Cx43在电击死者窦房结组织中的表达变化[J]. 法医学杂志 2015(04)
- [18].益阳活血方对损伤兔窦房结组织HCN4蛋白表达的影响[J]. 实用药物与临床 2012(03)
- [19].大鼠骨髓间充质干细胞移植梗死心肌HCN2及HCN4基因的表达[J]. 中国组织工程研究与临床康复 2010(01)
- [20].HCN4在缺血诱导乳兔窦房结细胞损伤中的作用[J]. 临床心血管病杂志 2017(12)
- [21].缺血再灌注条件下乳兔窦房结细胞HCN4表达变化及对起搏电流的影响[J]. 巴楚医学 2018(02)
- [22].HCN4转染大鼠骨髓间充质干细胞重建起搏离子通道I_f[J]. 基础医学与临床 2010(07)
- [23].体外诱导心肌样细胞中HCN4过表达对起搏电流特性的影响[J]. 中华实用诊断与治疗杂志 2018(10)
- [24].比索洛尔对大动脉水平左向右分流大鼠窦房结HCN2、HCN4通道mRNA表达及固有心率的影响[J]. 西安交通大学学报(医学版) 2013(02)
- [25].HCN4基因心脏起搏机制与心律失常关系研究进展[J]. 四川生理科学杂志 2008(03)
- [26].MicroRNA与HCN4在心脏节律控制中的作用研究进展[J]. 西南军医 2017(01)
- [27].大鼠心室肌HCN4质粒在HEK293细胞的表达及电流特征[J]. 宁夏医学院学报 2008(02)
- [28].转染人TBX18基因的大鼠心脏成纤维细胞中HCN4蛋白表达、If及对心肌细胞搏动频率的影响观察[J]. 山东医药 2016(47)
- [29].HCN4通道在OAB大鼠模型膀胱中的表达和意义[J]. 临床泌尿外科杂志 2015(10)
- [30].HCN4与心脏生物起搏研究进展[J]. 心电与循环 2015(01)