论文摘要
本研究以我国艰难梭菌菌株全基因组序列为基础,建立针对临床标本中艰难梭菌检测的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。以艰难梭菌毒素编码基因tcdB作为靶基因,克隆到pMD18-T载体,梯度稀释作为标准品并绘制标准曲线,以确定该方法的检测下限。利用各株艰难梭菌以及其它常见致病菌验证引物探针的特异性。多次重复求批内与批间变异系数,验证该方法的重复性。并制备模拟粪便混合标本,提取DNA进行检测,以达到快速检测的目的。结果显示,该方法特异性好,反应中只有艰难梭菌菌株有扩增信号,其他常见致病菌均无扩增反应。灵敏度高,由标准曲线得出目的基因的检测下限为52个拷贝/反应管（20μl体系）；重复性好,批内与批间变异系数小于5%；粪便标本中菌含量达到5.0×104CFU/g时即可被检出。本方法节省时间,粪便标本在2h内可出报告。该方法可用于临床标本中艰难梭菌的快速诊断,尤其对于国内未来可能的CDI爆发,该方法可提供快速准确的病原检测。鉴于常用分子检测靶点毒素编码基因tcdA和tcdB存在的基因多态性,本着寻找更为保守替代性靶点的目的,本研究对12株艰难梭菌的PaLoc区序列进行比较基因组分析,发现毒素分泌相关基因tcdE在PaLoc区的变异最小。接着,以tcdE为靶基因建立TaqMan-MGB荧光定量PCR方法,进行实验室方法建立的各项性质验证。为进一步评价该方法的实际应用性,收集13份临床疑似CDI病人腹泻标本进行检测,并与目前临床常规的两种诊断方法（tcdB-PCR及ToxinA/B检测试剂盒）进行比较。结果显示,该方法特异度高,重复性好,对标准质粒的检测下限为32个拷贝／反应管,并可检出粪便标本中9.0×104CFU/g的菌含量。在临床标本验证阶段,比商业Toxin A/B试剂盒更灵敏（P<0.05）,与tcdB-PCR方法检测情况无统计学差异（P>0.05）。该方法提出了产毒艰难梭菌分子检测的又一稳定靶标：tcdE基因。经比较基因组分析、实验室及临床应用性验证,初步评价良好。但是,在实际检测中是否优于tcdA和tcdB,需大规模的临床标本验证后方可得出结论。