共表达IBDV VP0、VP2基因的重组鸡痘病毒构建及实验免疫研究

论文摘要

鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的传染性法氏囊病（IBD）是鸡的急性、高度接触传染病。鸡早期感染IBDV后,对其他病毒和细菌的易感性增高,从而影响免疫接种效果,导致免疫失败。近年来,各地均有报道超强毒株（vvIBDV）及变异株能突破标准株的母源抗体的保护,给IBD的防制带来困难。现有疫苗存在易散毒、毒力返强等缺陷,研究新型疫苗已经成为当前的热点。本研究利用含双向启动子的转移载体质粒与鸡痘病毒通过TK基因同源重组获得高效表达IBDV-VP0-VP2的重组鸡痘病毒,并探讨其对IBDV的免疫保护作用。对于有效防治鸡传染性法氏囊病具有重要的现实意义。本研究通过鸡胚接种、琼脂扩散试验、动物回归试验、电镜观察、RT-PCR等方法进行IBDV的分离与鉴定。对分离株进行大量扩增、浓缩、纯化后作为抗原制备鸡和兔抗IBDV高免血清,用于后续试验检测。利用本实验室构建保存的载体pMTB18,构建了高效表达IBDV-VP0-VP2基因的转移质粒,并与鸡痘病毒282E4株（wtFPV） TK基因进行同源重组,通过加压筛选并纯化能稳定表达外源基因的重组rFPV-VP0-VP2株。对rFPV的基因组DNA提取后利用特异性引物进行PCR、RT-PCR、IFA等方法鉴定。将60只SPF鸡随机分为三组,分别用rFPV-VP0-VP2株、IBDV-B87弱毒疫苗株及对照剂（PBS）在10日龄时进行免疫,免疫后第三周用IBDV强毒分离株对免疫鸡攻毒,观察临床症状和发病情况,定期采血并分离血清,应用ELISA方法测定血清中抗体水平,以及IL-2、IL-4、IL-6、INF-γ的浓度。免疫后第三周采抗凝血分离外周血淋巴细胞,对其淋巴细胞增殖进行检测。确定其诱导机体产生体液免疫与细胞免疫的水平。结果成功分离了三株IBDV（IBDV-JL-01、02、03/2007）,其EID50分别为104.5/0.1mL、104.75/0.1mL、104.5/0.1mL;TCID50分别为107.43/0.1mL、106.75/0.1mL、106.5/0.1mL。应用分离株IBDV-JL01制备的鸡抗IBDV及兔抗IBDV琼扩效价均为1:256。通过筛选和鉴定,结果成功构建了pMTB18-VP0-VP2转移载体,并获得了rFPV-VP0-VP2株。重组病毒rFPV-VP0-VP2免疫SPF鸡后,通过ELISA抗体、细胞因子浓度、淋巴细胞转化率等检测,证实rFPV-VP0-VP2可以诱导SPF鸡产生较好的细胞免疫和体液免疫,但免疫效果低于经典弱毒疫苗株B87。综上所述,重组鸡痘载体活病毒可以刺激SPF鸡产生一定的细胞免疫与体液免疫,可在一定程度上抵抗IBDV强毒株的攻击。为研制高效疫苗预防鸡传染性法氏囊病提供了理论基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 鸡传染性法氏囊病的研究进展
• 1.1 概述
• 1.2 IBDV 的病原特性
• 1.2.1 IBDV 的基因组结构
• 1.2.2 病毒的形态发生
• 1.2.3 病毒蛋白
• 1.2.4 IBDV 毒株分类
• 1.2.5 培养特性
• 1.2.6 IBDV 的抵抗力
• 1.3 流行病学
• 1.3.1 自然宿主
• 1.3.2 传播媒介
• 1.3.3 潜伏期和症状
• 1.3.4 发病率和死亡率
• 1.4 IBDV 疫苗的研究进展
• 1.4.1 传统疫苗
• 1.4.2 基因工程疫苗
• 1.4.3 VP5 蛋白缺失IBDV 毒株
• 1.4.4 亚单位疫苗
• 1.4.5 DNA 疫苗
• 1.4.6 载体疫苗
• 1.4.7 烈性毒株疫苗
• 1.4.8 免疫复合物（immune complex）疫苗
• 1.4.9 可食用转基因植物疫苗（edible transgenic plant vaccine）
• 第二章 鸡痘病毒载体研究进展
• 2.1 痘病毒的分类
• 2.2 痘病毒载体的特点
• 2.2.1 痘病毒载体的优点
• 2.2.2 痘病毒载体的不足之处
• 2.3 痘病毒载体构建过程中的技术
• 2.3.1 病毒复制非必需区的选择
• 2.3.2 启动子的选择
• 2.3.3 外源基因所需满足的条件
• 2.3.4 同源重组法构建重组病毒
• 2.3.5 重组病毒筛选方法
• 2.4 禽痘病毒载体
• 2.4.1 禽痘病毒载体的特点
• 2.4.2 禽痘病毒载体的应用
• 2.5 本研究的目的意义和总体构思
• 第三章 IBDV 的分离、鉴定及抗IBDV 高免血清的制备
• 3.1 材料
• 3.1.1 病料
• 3.1.2 鸡胚与雏鸡
• 3.1.3 IBDV 琼脂免疫扩散试验及血凝试验标准抗原有血清
• 3.1.4 受体菌、质粒载体和主要试剂
• 3.1.5 主要设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 病料处理
• 3.2.2 病毒的分离与传代
• 3.2.3 毒价测定
• 3.2.4 血清学鉴定
• 3.2.5 动物回归试验
• 3.2.6 间接免疫荧光法检测（IFA）
• 3.2.7 电镜观察
• 3.2.8 IBDV 分离株RT-PCR 鉴定
• 3.2.9 病毒的浓缩与纯化
• 3.2.10 抗IBDV 的高免血清的制备
• 3.3 结果
• 3.3.1 鸡胚稳定性试验
• 3.3.2 IBDV 分离株在CEF 中的稳定性试验
• 3.3.3 IBDV 分离株毒价测定结果
• 3.3.4 血清学鉴定结果
• 3.3.5 动物回归试验结果
• 3.3.6 间接免疫荧光试验（IFA）结果
• 3.3.7 电镜结果
• 3.3.8 RT-PCR 电泳结果
• 3.3.9 重组质粒PCR 检测
• 3.3.10 病毒含量的测定
• 3.3.11 高免血清效价的测定结果
• 3.4 分析与讨论
• 3.5 小结
• 第四章 重组鸡痘病毒转移载体的构建与重组鸡痘病毒的筛选鉴定
• 4.1 材料
• 4.1.1 病毒、细胞、质粒、菌种
• 4.1.2 酶及主要试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 引物的设计与合成
• 4.2.2 重组鸡痘病毒转移载体pMTB18-VP0-VP2 的构建
• 4.2.3 鸡胚成纤维细胞的制备
• 4.2.4 FPV 毒价测定
• 4.2.5 鸡痘病毒细胞内同源重组方法
• 4.2.6 TK-鸡痘病毒的筛选
• 4.2.7 重组病毒表达产物的检测
• 4.3 结果
• 4.3.1 FPV 的毒价测定结果
• 4.3.2 VP0 和VP2 片段的扩增结果
• 4.3.3 重组质粒pMTB18-VP0-VP2 酶切鉴定电泳图
• 4.3.4 重组病毒的DNA 提取后的PCR 鉴定
• 4.3.5 重组病毒的RT-PCR 鉴定
• 4.3.6 重组病毒表达产物的间接免疫荧光（IFA）鉴定
• 4.3.7 rFPV 感染单位（U/mL）
• 4.4 分析与讨论
• 4.5 小结
• 第五章 重组鸡痘病毒对SPF 鸡的实验免疫研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 疫苗
• 5.1.2 雏鸡和鸡胚
• 5.1.3 细胞、病毒
• 5.1.4 试剂和抗体
• 5.1.5 主要仪器
• 5.2 方法
• 5.2.1 重组鸡痘病毒的滴定与增殖
• 5.2.2 重组鸡痘病毒动物免疫试验的试验设计
• 5.2.3 免疫学检测
• 5.2.4 免疫保护检测
• 5.2.5 试验数据的处理与统计
• 5.3 结果
• 5.3.1 重组鸡痘病毒的毒价测定结果
• 5.3.2 免疫学检测试验结果
• 5.3.3 免疫保护结果
• 5.4 分析与讨论
• 5.5 小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 作者简历
• 个人情况
• 教育背景
• 项目经历
• 英语及计算机能力
• 自我评价
• 在研期间发表论文