荣昌猪白细胞介素-2受体α基因克隆、原核表达及生物活性初探

论文摘要

T免疫细胞如T细胞、NK细胞、LAK细胞产生的细胞因子IL—2能与经抗原活化的T淋巴细胞表面的受体（IL-2Rα）相结合,诱导T细胞的快速增殖,产生排斥反应。根据Genbank基因序列号为U78317的猪白细胞介素-2受体α设计一对特异性引物,经刀豆蛋白素A（conA）诱导培养的荣昌猪外周血淋巴细胞（PBMC）并提取总RNA,RT-PCR方法首次扩增出荣昌猪IL-2Rα的全长基因,共813bp。利用NCBI网站软件BLAST进行同源性搜索,结果显示其与已公布的3个参考序列（登录号:NM213835.1 AF036005.1 AF052037.1）核苷酸同源性很高,均为98%以上。运用PCR技术从含荣昌猪IL-2Rα开放阅读框序列质粒中扩增其成熟蛋白编码基因共774bp。利用基因重组技术构建了PET32a（+）/IL-2Rα融合表达载体,经酶切鉴定,DNA测序证实重组质粒构建正确。将重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白约为45KD,Western blotting结果表明融合表达成功。并检测其可溶性,试验确定荣昌猪IL-2Rα重组成熟蛋白表达的最佳条件为IPTG 0.2 mmol/L,37℃诱导培养4h。重组蛋白以包涵体的形式表达,表达产物约占菌体总蛋白的42.6%。对小白鼠进行免疫试验,测定其CD3+、CD8+、CD4+.用所构建的重组表达质粒pcDNA-mpIL-2Rα免疫的小鼠的数量高于空质粒pcDNA-3.1（+）对照组、空白对照组和无任何试剂组。表明白介素-2受体α有一定的生物活性。本实验首次克隆出荣昌猪IL-2Rα基因并通过对基因序列改造后表达出融合蛋白,这为进一步研究荣昌猪IL-2Rα在体内外的作用和生理活性及在疾病、疫苗免疫中的作用提供了条件,同时对荣昌猪IL-2Rα深入研究可以为荣昌猪作为免疫移植的供体提供参考。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.1 IL-2
• 1.2 IL-2R
• 1.2.1 IL-2R的分子特性
• 1.2.2 IL-2R的信号传导途径
• 1.2.3 IL-2R的生物活性调节的受体
• 1.3 IL-2R α
• 1.3.1 IL-2R α的分子结构
• 1.3.2 IL-2R α形成的受体形式
• 1.3.3 IL-2R α的表位
• 1.4 IL-2R α对IL-2的研究
• 1.5 IL-2R α的生理功能
• 1.6 IL-2R α有关疾病的研究及应用前景
• 1.6.1 IL-2R α在抗排斥方面的研究及应用
• 1.6.2 IL-2R α在肿瘤方面的研究及应用
• 1.6.3 IL-2R α其他研究及应用
• 1.7 结语
• 第二章 荣昌猪IL-2Rα基因的克隆
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验动物
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 溶液配制
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 荣昌猪外周血淋巴细胞的分离与培养
• 2.2.2 荣昌猪淋巴细胞总RNA的抽提
• 2.2.3 RT-PCR扩增荣昌猪IL-2R α基因
• 2.2.4 荣昌猪IL-2R α基因克隆与测序
• 2.2.5 重组质粒的鉴定
• 2.2.6 荣昌猪IL-2R α基因生物信息学分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 荣昌猪IL-2R α基因的RT—PCR扩增
• 2.3.2 荣昌猪IL-2R α基因的重组质粒的酶切鉴定
• 2.2.3 荣昌猪IL-2R α基因重组质粒的序列测定
• 2.2.4 荣昌猪IL-2R α基因的进化树分析
• 2.2.5 荣昌猪IL-2R α的氨基酸序列
• 2.4 讨论
• 第三章 荣昌猪IL-2R α成熟蛋白的原核表达
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株、载体和实验动物
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 溶液的配制
• 3.2 方法
• 3.2.1 荣昌猪IL-2R α的成熟蛋白基因的扩增
• 3.2.2 荣昌猪IL-2R α成熟蛋白基因重组表达质粒的构建
• 3.2.3 pET-mpIL-2R α转化表达菌BL21
• 3.2.4 pET-mpIL-2R α的表达
• 3.2.5 重组菌的转录检测
• 3.2.6 诱导时间的优化
• 3.2.7 荣昌猪IL-2R α成熟蛋白的可溶性检测
• 3.2.8 荣昌猪IL-2R α成熟蛋白的Western-blot鉴定
• 3.2.9 荣昌猪IL-2R α成熟蛋白活性检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 pET-mpIL-2R α阳性质粒的鉴定
• 3.3.2 荣昌猪IL-2R α成熟蛋白的原核表达
• 3.3.3 重组菌的转录检测
• 3.3.4 目的蛋白表达量的分析
• 3.3.5 表达条件的优化
• 3.3.6 荣昌猪IL-2R α成熟蛋白Western-blot分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 信号肽
• 3.4.2 原核表达载体的选择
• 3.4.3 表达条件的优化
• 第四章 荣昌猪IL-2Rα生物活性初探
• 4.1 材料
• 4.1.1 实验动物
• 4.1.2 菌株和质粒
• 4.1.3 试剂
• 4.1.4 溶液配制
• 4.2 方法
• 4.2.1 pcDNA-mpIL-2Rα的构建
• 4.2.2 pcDNA-mpIL-2Rα的鉴定
• 4.2.3 重组阳性质粒的大量抽提
• 4.2.4 质粒的纯化
• 4.2.5 小白鼠实验
• 4.2.6 淋巴细胞的预处理及T细胞亚群的测定
• 4.3 结果
• 4.3.1 荣昌猪pcDNA-mpIL-2Rα的基因重组质粒分析
• 3+、CD⁸⁺、CD⁴⁺结果分析'>4.3.2 动物实验测定的CD³⁺、CD⁸⁺、CD⁴⁺结果分析
• 4.4 讨论
• 4.4.1 核酸疫苗
• 4.4.2 T淋巴细胞亚类
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 攻读学位期间发表的论文