论文摘要
背景和目的卵巢癌是一种常见的妇科恶性肿瘤，是临床上难治性肿瘤之一，由于位置深居盆底，缺乏早期症状和体征，75％-80％的患者确诊时已属晚期，造成卵巢癌诊断和治疗上的困难。因此，卵巢癌是死亡率最高、危害最大的妇科恶性肿瘤。溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）是一种细胞膜脂类衍生物，近年来研究发现卵巢癌患者血浆及腹水中LPA水平明显升高，体外实验证明降低LPA水平可以抑制卵巢肿瘤细胞增殖，促进其凋亡。LPA可促进卵巢癌细胞的增殖、生存、蛋白酶的产生和激活、促进血管生成因子等细胞因子的生成，与肿瘤的发生、发展、浸润、转移等密切相关。因而影响LPA的产生、代谢、受体表达及其信号转导通路对卵巢癌的发生发展有重要意义，有可能成为卵巢癌治疗的一种新途径。溶血磷脂酸即1-脂酰甘油3-磷酸酯（1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate），其基本结构包含磷酸基、甘油骨架及长链脂肪酸三部分。LPA是一种脂类小分子物质，是膜来源的具有生物活性的脂类递质，为脂质代谢的一个中间产物，有细胞间信号传导作用。LPA主要通过其受体即G蛋白受体介导的多种信号传导通路发挥其多样的生物学效应。目前已知的人类LPA受体有三种，即内皮分化基因蛋白（endothelial differentiation gene，Edg）Edg2，Edg4，Edg7。其中Edg2在正常卵巢细胞、永生化的卵巢细胞中均稳定表达，Edg4和Edg7则在卵巢癌细胞过表达，在正常卵巢细胞、永生化的卵巢细胞不表达或低表达。因此，Edg4和Edg7的表达可能与LPA对肿瘤的作用有关。近几年来兴起的RNA干扰技术，为肿瘤的分子生物学治疗开辟了新的途径。与传统基因沉默技术相比，RNA干扰技术具有效果强、持续时间长等优势，目前这一技术已在肿瘤的基因治疗方面显示出诱人的前景。本实验拟构建针对LPA受体Edg4的siRNA重组载体，将siRNA对应的DNA发卡样双链序列克隆入载体内，转染卵巢癌SKOV3细胞，在细胞内表达Edg4靶向的siRNA分子，特异性沉默Edg4基因，从而阻断LPA的作用，抑制卵巢癌细胞的生长，为卵巢癌的基因治疗寻找新的方法和靶点。方法依据GenBank中Edg4基因（NM004720）的序列，遵循http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA-design.html原则进行设计，对候选序列通过美国生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）的在线同源序列检索http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast，选择确定19个碱基的siRNA靶序列。分别合成2对靶向Edg4 siRNA序列，退火成双链DNA，克隆入pGEM-T Easy载体，利用α互补和T7／SP6 PCR扩增筛选鉴定重组子pGEM-T-siEdg4-1和pGEM-T-siEdg4-2；用BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶双酶切重组子和siRNA表达载体pRNAT-U6.1；将双粘Edg4发卡样siRNA片段亚克隆入siRNA表达载体pRNAT-U6.1中；利用通用引物筛选鉴定重组子pRNAT-U6.1-siEdg4-1和pRNAT-U6.1-siEdg4-2；对插入序列进行DNA序列分析。将siRNA表达载体pRNAT-U6.1-siEdg4-1和pRNAT-U6.1-siEdg4-2转染入人卵巢癌细胞系SKOV3中，利用荧光显微镜观察SKOV3细胞中的转染情况；用荧光定量PCR方法检测细胞Edg4 mRNA表达水平。结果1．针对Edg4 siRNA得到20个候选靶区段，对上述候选序列通过美国生物技术信息中心的在线同源序列检索，最后确定212-230位（GACCATCGGCTTCTTCTAT）和323-341位（GACCAATCTGCTGGTCATA）为siRNA靶序列。2．siRNA发卡DNA退火后，电泳可见明亮条带，位于约70bp处，与设计完全一致。3．退火产物与pGEM-T Easy连接后，转化JM109，筛选鉴定后得到重组子pGEM-T-siEdg4-1和pGEM-T-siEdg4-2。4．亚克隆后，用通用引物对重组质粒进行鉴定，得到pRNAT-U6.1-siEdg4-1和pRNAT-U6.1-siEdg4-2。5．对重组子pRNAT-U6.1-siEdg4-1和pRNAT-U6.1-siEdg4-2插入片段DNA序列测序，结果与设计完全一致。6．转染48小时后用荧光显微镜观察卵巢癌细胞可看见大量GFP表达，经G418筛选转染细胞得到对其有抗性的细胞群落。7．转染Edg4靶向siRNA（pRNAT-U6.1-siEdg4-1，pRNAT-U6.1-siEdg4-2）的实验组卵巢癌细胞中Edg4 mRNA表达水平明显降低。而两个对照组（空白对照组和空载体对照组）卵巢癌细胞系SKOV3细胞中都存在较高水平的Edg4 mRNA表达。结论1．设计出针对Edg4的发卡样siRNA寡核苷酸片段。2．成功构建出针对Edg4的siRNA表达载体pRNAT-U6.1-siEdg4-1和pRNAT-U6.1-siEdg4-2。3．pRNAT-U6.1-siEdg4-1和pRNAT-U6.1-siEdg4-2转染卵巢癌细胞系SKOV3后能显著降低细胞Edg4 mRNA表达。
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