栎皮黄酮处理结合茎尖培养脱除砂梨植株中潜隐病毒研究

论文摘要

苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV）、苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus,ASGV）和苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus,ASPV）是梨树上重要的潜隐病毒,广泛分布于世界各梨、苹果种植区。在梨树上潜隐病毒通常不产生明显的症状,但影响树势和降低产量。培育和栽培无病毒种苗是降低苹果和梨树病毒危害的最有效途径。化学处理是获得脱病毒种质的重要途径之一。本研究通过改进处理方法,分析了栎皮黄酮处理结合茎尖培养技术脱除梨树上3种主要潜隐病毒的效果,初步探索了砂梨离体植株生根技术,具体研究结果如下:1.采用RT-PCR技术,对黄花和金水2号两个品种的离体培养植株中ACLSV、ASGV和ASPV 3种病毒进行了检测,筛选出带有这3种病毒的离体植株,通过在MS继代培养基上扩繁,获得脱病毒处理材料。2.采用斑点杂交检测技术分析了25μg/ml水溶液直接浸泡预处理处理金水2号、金水1号和黄花带毒离体植株,对ACLSV、ASGV和ASPV的浓度的影响,结果显示,在处理2d后的离体植株中这3种病毒的杂交检测信号与未处理的带病毒离体植株无明显差别:而处理3d后,这3种病毒的杂交信号均未处理的带毒离体植株的杂交信号明显降低。3.采用25μg/ml和35μg/ml两种浓度的栎皮黄酮水溶液处理分别预处理3d和4d后,转入含有相应浓度栎皮黄酮的MS培养基中继续处理45d、50d、55d和60d,分别切取2mm、1mm和0.5mm大小的茎尖接种到MS培养基中继代培养一次,采用PAS-ELISA法检测所获再生植株中ACLSV、ASGV和ASPV 3种病毒含量的相对变化,结果表明,预处理3d和4d,再在含25μg/ml和35μg/ml栎皮黄酮的MS培养基中处理至第45后,3种病毒检测吸光值均有明显的下降,其中,ACLSV浓度在第55d和第60d下降最明显,以蒸馏水和已二醇单乙醚作相同处理的对照植株中,ELISA检测吸光值无明显差异。采用斑点杂交进一步检测各处理的脱病毒效果,检测的病毒包括ACLSV和ASPV,结果显示,用25μg/ml和35μg/ml栎皮黄酮处理50d和55d后取0.5mm茎尖再培养所获离体植株,无论预处理3d或4d,ACLSV、ASPV杂交信号均有明显的降低。用25μg/ml栎皮黄酮处理60后取0.5mm茎尖及35μg/ml栎皮黄酮预处理4d后在含同浓度的栎皮黄酮培养55d取0.5 mm获得的再生植株基本均无杂交信号。从检测结果还可看出,用浓度为35μg/ml栎皮黄酮处理较浓度为25μg/ml栎皮黄酮处理可降低杂交信号,但不能缩短完全脱毒所需时间;延长预处理时间至4d时,可缩短含栎皮黄酮培养基处理时间;所取茎尖大小对栎皮黄酮处理后的脱毒效果影响很明显,当所取茎尖为1mm时,处理60d后的再生植株中这两种病毒仍有较强的杂交信号。4.设计不同的生根培养基对5-6-45、金水2号和丰水三个品种进行生根试验,结果显示,5-6-45和金水2号在生根培养基1/2MS+2.0mg/LIBA+1.5mg/LNAA 2%蔗糖6.5g/L琼脂粉pH为5.8上的生根率达到90%以上,且根系发达。丰水在1/2MS（大量）+0.5 IBA+0.5 NAA2%蔗糖0.7%琼脂pH为5.8的生根培养基中,可以生根,但生根率低且根系不发达,对所获5-6-45和金水2号的生根离体植株进行了成功的移栽。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述:梨树上潜隐病毒的研究进展
• 1.1 砂梨上三种潜隐病毒的分布及危害
• 1.2 砂梨上三种潜隐病毒的理化特性
• 1.3 砂梨潜隐病毒的检测方法
• 1.3.1 生物学方法
• 1.3.2 血清学方法
• 1.3.3 分子生物学方法
• 1.3.3.1 PCR（Polymerase chain reaction）检测技术
• 1.3.3.2 核酸杂交（Nucleic acid hybridization）技术
• 1.4 梨树潜隐病毒的脱除
• 1.4.1 温度处理方法
• 1.4.2 茎尖培养法
• 1.4.3 热处理结合茎尖培养法
• 1.4.4 化学处理方法防治
• 1.4.4.1 化学方法防治病毒病的作用机理
• 1.4.4.2 植物病毒抑制剂
• 1.4.4.3 化学处理脱病毒
• 1.4.4.4 抗病毒抑制剂栎皮黄酮
• 1.5 研究的目的和意义
• 第二章 栎皮黄酮处理结合茎尖培养脱除砂梨病毒的效果
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 待处理砂梨样品
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 质粒和菌株
• 2.1.4 PCR引物
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 PAS-ELISA检测
• 2.2.2 试管捕捉RT-PCR（TC-RT-PCR）
• 2.2.3 斑点杂交检测
• 2.2.3.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及转化
• 2.2.3.2 质粒DNA的制备和纯化
• 2.2.3.3 快速的质粒DNA的制备和纯化
• 2.2.3.4 质粒DNA酶切
• 2.2.3.5 DNA片段的回收与纯化
• 2.2.3.6 核酸探针的标记
• 2.2.3.7 生物素标记探针的效价测定
• 2.2.3.8 斑点杂交（dot-blot hybridization）
• 2.2.3.9 检测步骤
• 2.2.3.10 ASPV探针的标记
• 2.2.4 栎皮黄酮处理与茎尖培养结合脱病毒
• 2.2.4.1 所需溶液的配制
• 2.2.4.2 离体培养植株在栎皮黄酮溶液中的浸泡处理
• 2.2.4.3 栎皮黄酮处理
• 2.2.4.4 茎尖培养脱病毒
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 待脱病毒处理砂梨离体植株病毒检测结果
• 2.3.2 栎皮黄酮浸泡对离体植株茎尖中病毒浓度影响
• 2.3.3 栎皮黄酮对砂梨离体植株生长的影响
• 2.3.4 栎皮黄酮处理结合茎尖培养对金水2号离体植株病毒浓度影响
• 2.3.5 栎皮黄酮处理结合茎尖培养对黄花离体植株病毒浓度影响
• 2.4 小结与讨论
• 第三章 不同砂梨品种生根技术研究
• 3.1 试验材料
• 3.2 生根培养基
• 3.2.1 以1/2MS培养基为基本生根培养基设计不同激素浓度的生根培养基
• 3.2.2 设计丰水梨的生根培养基
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 不同梨品种的生根试验
• 3.3.2 丰水梨的生根试验
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 不同品种的生根率及生根状况
• 3.4.2 丰水梨的生根率及生根状况
• 3.4.3 移栽
• 3.5 结论与讨论
• 附录
• 参考文献
• 致谢