电化学免疫传感器检测AFP和HIV p24的方法学研究

论文摘要

研究背景和目的原发性肝癌是发生在肝细胞或肝内胆管细胞的癌,死亡率仅次于胃癌和食管癌,是我国常见的恶性肿瘤之一,且发病率有上升趋势。在我国每年约有11万人死于肝癌,占全球肝癌死亡人数的45%。手术治疗仍是目前治疗原发性肝癌的最好方法,但是手术治疗往往给病人带来巨大痛苦和经济负担。为了降低原发性肝癌的发病率和死亡率、减少手术对病人的身体和精神负担,迫切地需要建立有效的原发性肝癌的筛查方案。肿瘤的筛查最简单实用的方法就是进行肿瘤标志物筛查。肿瘤标志物是癌细胞产生和释放的某些物质,常以抗原、酶、激素、代谢产物的形式存在于肿瘤细胞内或宿主体液中,根据其生化或免疫特性可以识别或诊断肿瘤。理想的肿瘤标记物应具有高特异性,适于人群普查。肿瘤标志物的血清学筛查可以简便的诊断癌症。就肝癌而言,甲胎蛋白（AFP）仍是特异性最强的标志物和诊断肝癌的主要指标。现已经广泛用于肝细胞癌的普查、诊断和判断治疗效果、预测复发。正常成人血清中AFP含量很少,高于20ng/ml就有患肝肿瘤的可能,因此,检测痕量AFP具有重要意义。基于同样的原因,我们对HIV的早期筛查进行了思考。获得性免疫缺陷综合征（Acquired immune deficiency syndrome）简称艾滋病（AIDS）,是由人类免疫缺陷病毒（Human immune deficiency virus, HIV）感染所引起的一种严重的传染性免疫缺陷性疾病。据卫生部统计,截至2010年10月底,我国累计报告艾滋病病毒感染者和病人37万多例,其中病人13万多例,死亡6万8千多例。局部地区和特定人群疫情严重,并逐渐由高危人群向一般人群扩散,防治形势非常严峻。由于HIV病毒具有高突变性的特点,目前尚无有效的预防疫苗和根治艾滋病的药物,预防感染成为控制HIV蔓延的主要手段,而HIV感染的实验室诊断是艾滋病预防控制工作的重要组成部分,因此建立敏感实用的检测方法用于监测、诊断或血液筛查,对控制艾滋病的流行显得尤为重要。根据血清学反应不同,HIV可分为HIV-1和HIV-2,其中HIV-1是广泛分布于世界各地,是造成全世界HIV/AIDS流行的主要原因。HIV病毒颗粒呈球形,二十面体立体对称,有gag、pol和env三种结构基因,分别合成核心蛋白（gag）、多聚蛋白（po1）、包膜蛋白（env）三种结构蛋白。HIV变异性很强,各基因的变异程度各不同,其中env基因变异率最高,gag和pol基因相对保守。p24蛋白包被在病毒核酸外面,构成病毒核衣壳的外壳,由gag基因编码前体蛋白,在pol基因编码的蛋白酶的加工下产生,因此p24蛋白氨基酸顺序高度保守,这使其在HIV感染的检测中显示出良好的规律性。p24抗原出现于HIV感染的早期,比抗体出现的时间要早,这是由于急性感染以后病毒发生了爆发性复制,与具有高度传染性的病毒血症相关联。对HIV p24蛋白进行早期检测在HIV早期感染检测、血液筛查、新生儿HIV感染的诊断和监测治疗的效果和病程的进展方面具有重要意义。但是HIV急性感染期后,体内出现特异性抗体,p24抗原与抗体形成免疫复合物,游离抗原浓度很低,常规方法无法检出,因此需要开发新的高敏感性方法,以便在低浓度情况下直接检出p24抗原。由以上分析可以得出,对AFP和HIV p24抗原进行痕量检测具有重要的意义,也成为临床检验诊断学研究的热点。近年来,免疫分析技术由于具有高灵敏度和高特异性,引起了研究者的兴趣。免疫分析技术是实现肿瘤和传染病快速诊断的重要手段,通过获取某种疾病的特异性“诊断蛋白”（diagnostic protein, DP,即抗原／抗体）含量和种类,综合分析可方便了解病情。近年来,免疫分析方法得到了长足的发展,建立了多种灵敏、高效的免疫分析方法,如凝集反应、荧光免疫测定技术（FIA）、放射免疫分析技术（RIA）、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、免疫印迹（WB）、化学发光免疫分析技术、电化学发光免疫分析技术、免疫芯片、免疫组织化学等,并且在许多临床疾病诊断中得到了广泛的应用。这些方法极大的促进了临床免疫项目的更新和检测的自动化、智能化以及网络化,但是仍然有许多不足：放射免疫技术是以放射性核素作为示踪元素的一种免疫标记测定技术,伴有不同程度的放射性污染；免疫印迹检测过程需要对蛋白质电泳分离,过程繁琐复杂,耗时较长；免疫组织化学需要借助显微镜的观测且制备繁琐；化学发光和电化学发光需要昂贵的仪器,成本较高；其他如凝集反应、胶体金免疫技术等其特异性和敏感性低,且不能准确定量。基层医疗机构尤其是偏远地区受到条件限制,特别是在急诊手术前需要对病人进行快速筛检,受到常规检测方法灵敏度低、特异性差和需时长、操作复杂的限制常规方法常常不能满足要求；出于隐私和害怕受到歧视的原因,HIV“高危人群”往往不愿意到医院、疾控中心等部门进行检测。综上所述,现有方法不能满足原发性肝癌和HIV感染筛查需求,急需开发一种简便快速、灵敏度高、特异性好、价格便宜、携带方便的快速筛查技术及其相关设备,此类仪器的开发成功对预防和控制艾滋病的传播具有非常重要的意义。1990年Herry等提出了免疫传感器的概念。免疫传感器利用抗体和抗原反应的高亲和力和分子识别能力,结合了传统的免疫测试法和生物传感器技术,使其具有实时输出、高灵敏性、高特异性、操作简便和价格低廉的优点,已经在食品临床诊断、环境监测、食品安全等领域得到广泛应用。围绕以上问题,本论文的工作首先是利用层层自组装技术制备了基于碳纳米管修饰的无酶型新型甲胎蛋白安培免疫传感器,该免疫传感器器对AFP具有很好的灵敏度。其次,通过在玻碳电极表面直接电镀金的方法,通过“三明治”型夹心法制备了新型HIV p24安培免疫传感器,并初步优化了检测条件。研究方法1.基于碳纳米管修饰的无酶型新型甲胎蛋白安培免疫传感器研究首先在玻碳电极（GCE）表面修饰一层羧基化碳纳米管（CNTs）,然后利用带负电荷的DNA分子和带正电荷的硫瑾之间的静电作用,层层自组装修饰硫瑾以增强检测信号,然后利用硫瑾的氨基固定纳米金,以便固定抗体,最后利用牛血清白蛋白封闭未结合位点。制备的电极与AFP标准品温育,通过检测传感器电流来对AFP定量。2.基于玻碳电极表面直接电镀金修饰的夹心型HIV p24安培免疫传感器研究将打磨抛光好电极放在在1%的氯金酸溶液中,在-0.2V,用电流时间曲线法施加恒电位20S.然后将电极浸入anti-p24一抗,4℃过夜孵育。充分洗涤,除去非特异性结合抗体,然后用牛血清白蛋白封闭剩余活性位点。这样即制备出基于直接电镀金修饰的p24安培免疫传感器。将传感器与24抗原温育后,形成免疫复合物,洗涤,再将传感器与过氧化物酶标记的二抗（HRP-Ab2）温育,电极表面形成夹心免疫复合物。利用对苯二酚作为信号分子,辣根过氧化物酶催化对苯二酚与过氧化氢的反应,反应前后电流改变值大小与电极表面酶含量多少成正比,而酶的含量与抗原量相关,即传感器电流改变值与抗原量相关,以此作为p24抗原定量依据。结果1成功构建了基于碳纳米管修饰的无酶型新型甲胎蛋白安培免疫传感器,该传感器利用带负电荷的DNA分子与带正电荷的硫瑾直接的静电吸引作用,逐层修饰信号分子硫瑾。当硫瑾修饰五层时,信号达到最大值。在pH7.0,温育时间30min条件下,该传感器在0.5—25ng/ml范围内甲胎蛋白具有良好的检测线性。2成功构建了直接电镀金修饰的电极的夹心型HIV p24安培免疫传感器。该传感器利用电流时间曲线法在玻碳电极表面电镀纳米金后,电极的的导电性和可逆性均提高。同时纳米金可大量固定抗体并保持其生物活性。制备的传感器依次与抗原、二抗反应后,在电极表面形成夹心免疫复合物,二抗上的辣根过氧化物酶催化过氧化氢与对苯二酚的反应,在循环伏案图中表现为氧化电流的减小和还原电流的上升。传感器在0.01—100ng/mL范围内有良好的线性。结论本研究成功采用两种不同的电极修饰方法分别制备了可以高灵敏度检测AFP和p24蛋白的安培免疫传感器,有望为临床上检测原发性肝癌和HIV感染提供新的方法。两种电极的制备表明：1)利用DNA分子可以在电极表面成功修饰多层硫瑾分子,并可以提高传感器的信号强度。2)通过在电极表面直接电镀金的方法可以直接在玻碳电极表面修饰一层纳米金,为抗体的固定提供了一种简单快捷的方法。这两种传感器的制备具有通用性,即只要改变传感器制备过程修饰的抗体,即可制备检测不同蛋白的安培免疫传感器,为其他肿瘤标志物和感染性疾病提供参考。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 基于碳纳米管修饰的无酶型新型甲胎蛋白安培免疫传感器研究
• 1.1 仪器与试剂
• 1.2 方法
• 1.3. 结果
• 1.4 讨论
• 参考文献
• 第二部分 直接电镀金修饰电极的夹心型HIV-P24安培免疫传感器研究
• 2.1 仪器与试剂
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 综述
• 参考文献
• 研究生期间主要成果
• 致谢
• 统计学证明